von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 063 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:18:54 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 63, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 44, 45, Zeilen: 44: 18ff; 45: 1ff |
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| 3.3.3 Transformation von Bakterien
3.3.3.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien Der E. coli Stamm wird auf einer LB-Agarplatte ausgestrichen und O/N bei 37 °C inkubiert. 10 ml TYM-Medium werden mit einer Kolonie angeimpft und bei 37 °C und 250 rpm für ca. 4-5 h inkubiert, bis eine OD600nm von 0.5-0.6 erreicht ist. Die Vorkultur wird mit TYM-Medium auf 100 ml aufgefüllt und weiter für ca. 1.5 h inkubiert. Die Kultur wird anschließend mit 400 ml TYM-Medium aufgefüllt, für eine weitere Stunde inkubiert und anschließend für 10 Min in einem Eiswasserbad unter Schwenken abgekühlt. Die Bakterien werden für 10 Min bei 4 °C und 2500 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge geerntet. Es folgt eine Resuspension der Bakterien in 100 ml vorgekühltem TfB1 und eine neuerliche Zentrifugation für 10 Min bei 4 °C und 2500 x g. Die Bakterien werden in 10 ml eiskaltem TfB2 resuspendiert und in 300 μl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Aliquots werden bei -80 °C überführt, was eine dauerhafte Lagerung ermöglicht. Es wird je ein Aliquot auf einer LB-Platte mit Kanamycin und Ampicillin ausgestrichen und O/N bei 37 °C inkubiert, um eine unerwünschte Ausbildung spontaner Antibiotikaresistenzen auszuschließen. Durch die Transformation von 1 ng einer bekannten Plasmid-DNA wird die Kompetenz der hergestellten Bakterien ermittelt, wobei ein Wert von 107 Kolonien/μg DNA erreicht werden sollte. 3.3.3.2 Transformation Für die Transformation mit Plasmid-DNA wird ein Aliquot des kompetenten E. coli Stammes auf Eis aufgetaut, mit der Plasmid-DNA (Bakterien : Plasmid-DNA 10:1) versetzt und für 30 Min auf Eis inkubiert. Anschließend wird ein Hitzeschock für 45 Sek bei 42 °C durchgeführt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 1 Min auf Eis wird die Bakteriensuspension mit 300 μl LB/Glucose für 1 h bei 37 °C und 250 rpm regeneriert. Die Selektion erfolgt nach dem Ausstreichen der Bakterien auf LB-Agarplatten, die ein entsprechendes Antibiotikum beinhalten. |
3.3.3 Transformation von Bakterien
3.3.3.1 Herstellung chemisch kompetenter Bakterien Der E. coli Stamm wird auf einer LB-Agarplatte ausgestrichen und O/N bei 37°C inkubiert. 10 ml TYM-Medium werden mit einer Kolonie angeimpft und bei 37°C und 250 rpm für ca. 4 - 5 h inkubiert, bis eine OD600nm von 0.5 - 0.6 erreicht ist. Die Vorkultur wird mit TYM-Medium auf 100 ml aufgefüllt und weiter für ca. 1.5 h inkubiert. Die Kultur wird anschließend mit TYM-Medium auf 400 ml aufgefüllt, für eine weitere Stunde inkubiert und anschließend für 10 Min in einem Eiswasserbad unter Schwenken abgekühlt. Die Bakterien werden für 10 Min bei 4°C und 2.500 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge pelletiert. Es folgt eine Resuspension der Bakterien in 100 ml vorgekühltem TfB1 und eine neuerliche Zentrifugation für 10 Min bei 4°C und 2.500 x g. Die Bakterien werden in 10 ml eiskaltem TfB2 resuspendiert und in 300 μl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Aliquots werden in -80°C überführt, was eine dauerhafte Lagerung ermöglicht. Es wird je ein Aliquot auf einer LB-Platte mit Kanamycin und Ampicillin ausgestrichen und O/N bei 37°C [Seite 45] inkubiert, um eine unerwünschte Ausbildung spontaner Antibiotikaresistenzen auszuschließen. Durch die Transformation von 1 ng einer bekannten Plasmid-DNA wird die Kompetenz der hergestellten Bakterien ermittelt, wobei ein Wert von 107 Kolonien/μg erreicht werden sollte. 3.3.3.2 Transformation Für die Transformation mit Plasmid-DNA wird ein Aliquot des kompetenten E. coli Stammes auf Eis aufgetaut, mit der Plasmid-DNA (Bakterien: Plasmid-DNA 10:1) versetzt und für 30 Min auf Eis inkubiert. Anschließend wird ein Hitzeschock für 45 Sek bei 42°C durchgeführt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 5 Min auf Eis wird die Bakteriensuspension mit 300 μl SOC-Medium für 1 h bei 37°C und 250 rpm ankultiviert. Die Selektion erfolgt nach dem Ausstreichen der Bakterien auf LB-Agarplatten, die ein entsprechendes Antibiotikum beinhalten. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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