von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 057 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:26:39 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 57, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 39, Zeilen: 1ff |
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| 3.2.4 Coomassie-Färbung von Proteingelen
Nach der Gelelektrophorese wird das Gel für 5-10 Min in Fixierlösung und für 30 Min (bis O/N) in der Coomassie-Gebrauchslösung inkubiert. Im Anschluss wird das Gel mit Destaining Solution entfärbt, bis Proteinbanden sichtbar werden. Mit Hilfe eines Durchlicht Scanners erfolgt eine Aufnahme des Gels. 3.2.5 Western Blot Zur Durchführung eines „semi-dry“ Western Blots wird ein 3 mm starkes Whatmanpapier in Größe des Gels in Transferpuffer getränkt. Darauf wird eine in Methanol equilibrierte PVDF-Membran gelegt. Als nächstes wird das SDS-PAA-Gel auf der Membran platziert, worauf sich wieder ein Whatmanpapier anschließt. Diese Mehrfachschichtung wird, gut in Transferpuffer getränkt und frei von Luftblasen, auf die Anode der Blotkammer gelegt, welche sodann mit der Kathode verschlossen wird. Da die negativ geladenen Proteine aus dem Gel auf die Membran transferiert werden sollen, ist darauf zu achten, dass die Membran zwischen Gel und Anode zu liegen kommt. Der Proteintransfer erfolgt bei 12 V für 2 h. Zur Überprüfung des erfolgten Transfers wird die Membran in Ponceau-S-Lösung inkubiert und mit H20 gewaschen, bis eindeutige Proteinbanden zu erkennen sind. Nach einer vollständigen Entfärbung der Membran wird mit der Antikörper-Detektion fortgefahren. 3.2.6 Immunologischer Nachweis Bevor es zum Einsatz von Antikörpern kommt wird die PVDF-Membran zur Absättigung freier Proteinbindungsstellen für 1,5 h bei RT oder O/N bei 4 °C in 10 % Milchpulver geblockt. Die nachfolgenden Waschschritte, die Verdünnung der BSA-Lösung und die der Antikörper, erfolgt in TBS-T. Es folgt der immunologische Nachweis durch Inkubation mit dem spezifisch bindenden Primärantikörper für 1,5 h bei RT. Nach dreimaligem Waschen für 5 Min folgt eine Inkubation mit dem peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper. Nach erneutem, intensivem Waschen der Membran, erfolgt die Detektion mit Hilfe von Lumi Light Plus® von Roche. Das durch die Peroxidasereaktion entstehende Licht wird mit einem Röntgenfilm detektiert. |
3.2.5 Coomassie-Färbung von Proteingelen
Nach der Gelelektrophorese wird das Gel für 5 - 10 Min in Fixierlösung und für 30 Min (bis O/N) in der Coomassie-Gebrauchslösung inkubiert. Im Anschluss wird das Gel mit Destaining Solution entfärbt, bis Proteinbanden sichtbar werden. Mit Hilfe eines Durchlicht Scanners erfolgt eine Aufnahme des Gels. 3.2.6 Western Blot Zur Durchführung eines „semi-dry“ Western Blots wird ein 3 mm starkes Whatmanpapier in Größe des Gels in Transferpuffer getränkt. Darauf wird eine in Methanol equilibrierte PVDF-Membran gelegt. Als nächstes wird das SDS-PAA-Gel auf der Membran platziert, worauf sich wieder ein Whatmanpapier anschließt. Diese Mehrfachschichtung wird gut in Transferpuffer getränkt und frei von Luftblasen auf die Graphit-Anode der Blotkammer gelegt, welche mit der Kathode verschlossen wird. Da die negativ geladenen Proteine aus dem Gel auf die Membran transferiert werden sollen, ist darauf zu achten, dass die Membran zwischen Gel und Anode zu liegen kommt. Der Proteintransfer erfolgt bei 12 V für 2 h. Zur Überprüfung des erfolgten Transfers wird die Membran in Ponceau-S-Lösung inkubiert und mit TBS-T gewaschen, bis eindeutige Proteinbanden zu erkennen sind. Nach einer vollständigen Entfärbung der Membran wird mit der Antikörper-Detektion fortgefahren. 3.2.6.1 Immunologische Nachweise Bevor es zum Einsatz von Antikörpern kommt, wird die PVDF-Membran zur Absättigung freier Proteinbindungsstellen für 1 h bei 37°C oder O/N bei 4°C in 5 % BSA-Lösung in TBS-T geblockt. Die nachfolgenden Waschschritte und die Verdünnung der Antikörper erfolgt in TBS-T. Es folgt der immunologische Nachweis durch Inkubation mit dem spezifisch bindenden Primärantikörper für 1 h bei RT. Nach dreimaligem Waschen für 5 Min folgt eine Inkubation mit dem peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper. Nach erneutem, intensivem Waschen der Membran, erfolgt die Detektion der Proteinbanden durch die ECL-Reaktion (Vgl. Material 2.3.1). Das durch die Peroxidasereaktion entstehende Licht wird mit einem Röntgenfilm detektiert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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