von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 053 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:28:50 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 53, Zeilen: 1-19 |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 37, Zeilen: 8ff |
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| 3.2.2 Proteinexpression und Proteingewinnung im eukaryoten System
Für die Gewinnung endogen exprimierter Proteine aus kultivierten, eukaryoten Zellen kann je nach gewünschter Proteinzusammensetzung eine Fraktionierung erfolgen oder ein Volllysat hergestellt werden. Um die Proteine zu gewinnen, werden die Zellen einer konfluenten 10 cm Kulturschale zunächst mit 1 x PBS (4 °C) gewaschen. Mit einem Zellschaber werden die Zellen in 10 ml 1 x PBS (4 °C) mechanisch von der Kulturschale gelöst und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach einer Zentrifugation bei 4 °C für 5 Min und 1 000 rpm wird das entstandene Zellpellet auf Eis in 300 μl IP-Puffer (Gebrauchslösung, frisch angesetzt) lysiert. Während einer 30 Min Inkubation auf Eis erfolgt eine mechanische Homogenisierung des Lysats mit einer 1 ml Spritze mit Kanüle (20G). Es schließt sich eine Zentrifugation für 15 Min bei 4 °C und 18 000 rpm an. Der Überstand mit den löslichen Proteinen kann bei -20 °C gelagert oder für ein Experiment eingesetzt werden. Um größere Mengen eines gewünschten Proteins zu gewinnen, das ein zu hohes spezifisches Molekulargewicht für das bakterielle Expressionssystem hat, können eukaryote Zellen mit einem geeigneten Expressionsvektor transfiziert werden. Diese verstärkt exprimierten, posttranslational modifizierten Proteine werden analog zu den endogen exprimierten Proteinen gewonnen. Die Proteine werden 24-48 h nach der Transfektion gewonnen. |
3.2.2 Proteinexpression und Proteingewinnung im eukaryoten System
Für die Gewinnung endogen exprimierter Proteine aus kultivierten, eukaryoten Zellen, kann je nach gewünschter Proteinzusammensetzung eine Fraktionierung erfolgen oder ein Vollysat hergestellt werden. Um die zytosolische Proteinfraktion zu gewinnen, werden die Zellen einer konfluenten 10 cm Kulturschale zunächst mit 1 x PBS (4°C) gewaschen. Mit einem Zellschaber werden die Zellen in 10 ml 1 x PBS (4°C) mechanisch von der Kulturschale gelöst und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Nach einer Zentrifugation bei 4°C für 5 Min und 1.000 rpm wird das entstandene Zellpellet auf Eis in 300 μl IP-Puffer (Gebrauchslösung, frisch angesetzt) lysiert. Während einer 15 Min Inkubation auf Eis erfolgt eine mechanische Homogenisierung des Lysats mit einer 1 ml Spritze mit Kanüle (20G). Es schließt sich eine Zentrifugation für 15 Min bei 4°C und 18.000 rpm an. Der Überstand mit den löslichen, zytosolischen Proteinen kann bei -80°C gelagert oder für ein Experiment eingesetzt werden. Um größere Mengen eines gewünschten Proteins zu gewinnen, das ein zu hohes spezifisches Molekulargewicht für das bakterielle Expressionssystem hat, können eukaryote Zellen mit einem geeigneten Expressionsvektor transfiziert werden (Vgl. 3.3.4). Diese verstärkt exprimierten, posttranslational modifizierten Proteine werden analog zu den endogen exprimierten Proteinen gewonnen. Die Proteine werden 24 - 48 h nach der Transfektion gewonnen. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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