von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 052 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:29:56 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 52, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 36, 37, Zeilen: 36: 12ff; 37: 1-7 |
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| Die Hauptkultur wird bei einer OD600nm von 0.6 mit 1 mM IPTG versetzt und für 2-3 h bei 30 °C weiter kultiviert. Durch Zentrifugation bei 4 500 rpm für 20 Min bei 4 °C werden die Bakterienzellen pelletiert und anschließend in 15 ml Column-Puffer resuspendiert. Es folgt ein Einfrierschritt zur weiteren Lyse der Bakterienzellwände und zum Aufbrechen eventueller Einschlusskörperchen (inclusion bodies) in flüssigem Stickstoff. Die lysierten, schockgefrorenen Bakterien werden auf Eis aufgetaut, einer Ultraschallbehandlung (3 x 30 Sek 50 %) unterzogen und erneut bei 12 000 rpm und 4 °C für 20 Min zentrifugiert. Der entstandene Überstand („crude lysate“) wird zum Schutz vor Proteasen mit 0.25 mM PMSF versetzt.
3.2.1.3 Konzentrationsbestimmung der GST-Fusionsproteine Zur Konzentrationsbestimmung des rekombinanten Fusionsproteins wird 1 ml crude lysate mit 20 μl equilibrierter Glutathion Sepharose inkubiert. Nach 1h Inkubation bei 4 °C O/H folgen drei Waschschritte mit Column-Puffer. Das rekombinante GST-Fusionsprotein ist nun an der Glutathion-Sepharose immobilisiert und wird mit 20 μl 2x Laemmli-Probenpuffer für 5 Min bei 95 °C eluiert. Zusammen mit einer BSA-Standardreihe (1, 2.5 und 5 μg Protein) wird die Probe mittels SDS-PAGE aufgetrennt, um anschließend mit einer Coomassie-Färbung die Konzentration zu ermitteln. Das übrige crude lysate kann direkt für einen pulldown eingesetzt oder bis zu seiner Verwendung bei -20 °C gelagert werden. 3.2.1.4 Durchführung des GST-pulldowns Für den GST-pulldown werden 1-10 μg des GST-Fusionsproteins an 20 μl equilibrierter Glutathion-Sepharose immobilisiert und nach fünfmaligem Waschen mit Column-Puffer mit Zell- oder Gewebelysat (50-100 μg Gesamtprotein) versetzt. Es schließt sich eine Inkubation von 3-5 h bei 4 °C O/H an. Nach weiteren fünf Waschschritten mit IP-Puffer wird die Probe mit 20 μl 2x Laemmli-Probenpuffer für 5 Min bei 95 °C eluiert und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Im Anschluss folgt eine Western Blot Analyse. |
Die Hauptkultur wird bei einer OD600nm von 0.6 mit 1 mM IPTG versetzt und für 2 - 3 h bei 30°C weiter kultiviert. Durch Zentrifugation bei 4.500 rpm für 20 Min bei 4 °C werden die Bakterienzellen pelletiert und anschließend in 15 ml Column-Puffer resuspendiert. Es folgt ein Einfrierschritt zur weiteren Lyse der Bakterienzellwände und zum Aufbrechen eventueller Einschlusskörperchen (inclusion bodies) in flüssigem Stickstoff. Die lysierten, schockgefrorenen Bakterien werden auf Eis aufgetaut, einer Ultraschallbehandlung (3 x 30 Sek 50 %) unterzogen und erneut bei 12.000 rpm und 4 °C für 20 Min zentrifugiert. Der entstandene Überstand („crude lysate“) wird zum Schutz vor Proteasen mit 0.25 mM PMSF versetzt.
3.2.1.3 Konzentrationsbestimmung der GST-Fusionsproteine Zur Konzentrationsbestimmung des rekombinanten Fusionsproteins wird 1 ml crude lysate mit 20 μl equilibrierter Glutathion Sepharose (GS beads) inkubiert. Nach 1 h Inkubation bei 4°C O/H folgen drei Waschschritte mit Column-Puffer. Das rekombinante GST-Fusionsprotein ist nun an der GS-Sepharose immobilisiert und wird mit 20 μl 2 x Laemmli-Probenpuffer für 5 Min bei 95°C gekocht. Zusammen mit einer BSA-Standardreihe (1, 2.5 und 5 μg Protein) wird die Probe mittels SDS-PAGE aufgetrennt, um anschließend mit einer Coomassie-Färbung die Konzentration zu ermitteln. Das übrige crude lysate kann direkt für einen pulldown eingesetzt oder bis zu seiner Verwendung bei –80°C gelagert werden. [Seite 37] 3.2.1.4 Durchführung des GST-pulldowns Für den GST-pulldown werden 1 - 10 μg des GST-Fusionsproteins an 20 μl equilibrierter Glutathion-Sepharose immobilisiert und nach fünfmaligem Waschen mit Column-Puffer mit Zell- oder Gewebelysat (50 - 100 μg Gesamtprotein) versetzt. Es schließt sich eine Inkubation von 3 - 5 h bei 4°C O/H an. Nach weiteren fünf Waschschritten mit IP-Puffer wird die Probe mit 20 μl 2 x Laemmli-Probenpuffer für 5 Min bei 95°C gekocht und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Im Anschluss folgt eine Western Blot Analyse. |
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