von Dr. Sandro Lorenz
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| [1.] Slo/Fragment 049 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-07-17 20:38:37 WiseWoman | Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schurek 2007, Schutzlevel sysop, Slo, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 49, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Schurek 2007 Seite(n): 33, 34, Zeilen: 33: 6ff; 34: 8ff |
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| 3.1.3 Restriktionsanalyse
Es werden 250 ng bis 1 μg DNA mit 1 bis 4 U der entsprechenden Restriktionsendonuklease mit dem für diese vorgesehenen Puffer versetzt und nach Angaben des Herstellers behandelt. Üblicherweise wird der Restriktionsansatz für 1 h bei 37 °C inkubiert und anschließend für 10 Min bei 70 °C hitzeinaktiviert. 3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese (McDonell et al. 1977) Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt in Agarosegelen (0.5-2 % w/v Agarose in 1x TAE-Puffer) mit 0.005 % Ethidiumbromidlösung bei 100-130 V. 3.1.5 Aufreinigung von DNA-Fragmenten Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten oder PCR-Reaktionslösungen aus Agarosegelen wird das Gel Extraction Kit® und das PCR Purification Kit® von Qiagen nach Herstellerangaben verwendet. Dazu wird die Probe (verdaute Insert- oder Vektor-DNA bzw. PCR-Ansatz) in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend auf einem UV-Tisch aus dem Gel geschnitten. Die erfolgreiche Aufreinigung der DNA wird durch erneutes Auftragen eines Aliquots der Gel eluierten DNA verifiziert, wobei gleichzeitig eine Abschätzung der DNA-Menge erfolgt. 3.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten Um DNA-Fragmente zu klonieren werden die aus Agarosegelen aufgereinigte Insert-DNA und Vektor-DNA in einem Mol-Verhältnis von 1:3 (bei kohäsiven Enden) in einem Volumen von 20 μl mit 2 U T4-DNA-Ligase und einer entsprechenden Menge T4-Ligase-Puffer versetzt und über Nacht bei 16 °C inkubiert. Anschließend wird der Bakterien-Stamm DH5α mit der Ligationsreaktion transformiert. 3.1.7 Plasmidpräparation Um eine erfolgreiche Klonierung sicher zu stellen, werden einzelne Klone der transformierten Bakterien in Flüssigkultur (LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum) angeimpft und O/N bei 37 °C und 250 rpm inkubiert. |
3.1.5 Restriktionsanalyse
Es werden 250 ng bis 1 μg DNA mit 1 bis 4 U der entsprechenden Restriktionsendonuklease mit dem für diese vorgesehenen Puffer versetzt und nach Angaben des Herstellers behandelt. Üblicherweise wird der Restriktionsansatz für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend für 10 Min bei 70°C hitzeinaktiviert. [Seite 34] 3.1.7 Agarose-Gelelektrophorese (McDonell et al. 1977)[57] Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt in Agarosegelen (0.5 - 2 % w/v Agarose in 1 x TAE-Puffer) mit 0.005 % Ethidiumbromidlösung bei 100-130 V. 3.1.8 Aufreinigung von DNA-Fragmenten Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten oder PCR-Reaktionslösungen aus Agarosegelen wird das Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System von Promega nach Herstellerangaben verwendet. Dazu wird die Probe (verdaute Insert- oder Vektor-DNA bzw. PCR-Ansatz) in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend auf einem UV-Tisch aus dem Gel geschnitten. Die erfolgreiche Aufreinigung der DNA wird durch erneutes Auftragen eines Aliquots der Gel eluierten DNA verifiziert, wobei gleichzeitig eine Abschätzung der DNA-Menge erfolgt. 3.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten Um DNA-Fragmente zu klonieren, werden die aus Agarosegelen aufgereinigte Insert-DNA und Vektor-DNA in einem Mol-Verhältnis von 1:3 (bei kohäsiven Enden) in einem Volumen von 20 μl mit 2 U T4-DNA-Ligase und einer entsprechenden Menge T4-Ligase-Puffer versetzt und für 2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird der Bakterien-Stamm DH5α mit der Ligationsreaktion transformiert (Methoden, 3.3.3.2). 3.1.10 Plasmidpräparation Um eine erfolgreiche Klonierung sicher zu stellen, werden einzelne Klone der transformierten Bakterien in Flüssigkultur (LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum) angeimpft und O/N bei 37°C und 250 rpm inkubiert. [...] |
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