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| Untersuchte Arbeit: Seite: 41, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 45, Zeilen: 45: 19ff; 48: 23ff |
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| Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für weitere Analysen verwendet. Das Pellet wird in 50 μl SDS-Probenpuffer (s. 2.2.6.3) resuspendiert.
6.2.2.4. Expression von rekombinantem Protein in S. cerevisiae Die Expressionen werden unter den ermittelten Bedingungen für eine optimale Proteinausbeute durchgeführt. Einzelne Kolonien werden in 5 ml Minimalmedium bis zur Sättigung bei 30 °C kultiviert. Mit 1 ml dieser Vorkultur werden 100 ml Minimalmedium beimpft und bis zu einer OD600 von 1 bei 30 °C kultiviert. Durch Zugabe von 2% (v/v) Galactose wird die Proteinexpression induziert. Nach 6 h werden die Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 x g und 4 °C pelletiert und das Zellpellet bei -20 °C gelagert oder direkt lysiert, indem die Zellen in 1 ml Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM DTT / 1 mM PMSF) resuspendiert werden und ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben wird. Die Zellen werden, wie unter 2.2.3.3 beschrieben, mechanisch durch Scherkräfte aufgebrochen und Zelltrümmer und unlösliche Komponenten bei 20000 x g und 4 °C für 10 min abzentrifugiert. Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für die beschriebenen Experimente eingesetzt. 6.2.2.5. Lyse von Hefezellen Die geernteten Hefezellen von 1 ml Hefekultur werden in 100 μl Lysepuffer (10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 / 1 mM DTT / 1 mM EDTA / 1 mM PMSF) resuspendiert und ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben. Die Zellsuspension wird für 30 sec gevortext und anschließend 30 sec auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wird achtmal wiederholt, damit die Zellen komplett lysiert sind. Zelltrümmer und unlösliche Komponeten werden im Anschluß bei 20000 x g und 4 °C für 30 min abzentrifugiert. Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für weitere Analysen verwendet. Das Pellet wird in 100 μl Lysepuffer resuspendiert und den gleichen Analysen unterzogen. |
Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für weitere Analysen verwendet. Das Pellet wird in 50 μl SDS-Probenpuffer (s. 2.2.6.3) resuspendiert.
2.2.3.4 Expression von rekombinantem Protein in Saccharomyces cerevisiae Die Expressionen werden unter den ermittelten Bedingungen für eine optimale Proteinausbeute durchgeführt. Einzelne Kolonien werden in 5 ml Minimalmedium bis zur Sättigung bei 30 °C kultiviert. Mit 1 ml dieser Vorkultur werden 100 ml Minimalmedium beimpft und bis zu einer OD600 von 1 bei 30 °C kultiviert. Durch Zugabe von 2% (v/v) Galactose wird die Proteinexpression induziert. Nach 6 h werden die Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 x g und 4 °C pelletiert und das Zellpellet bei -20 °C gelagert oder direkt lysiert, indem die Zellen in 1 ml Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM DTT / 1 mM PMSF) resuspendiert werden und ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben wird. Die Zellen werden, wie unter 2.2.3.3 beschrieben, mechanisch durch Scherkräfte aufgebrochen und Zelltrümmer und unlösliche Komponenten bei 20000 x g und 4 °C für 10 min abzentrifugiert. Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für die beschriebenen Experimente eingesetzt. [Seite 48] 2.2.4.6 Lyse von Hefezellen Die geernteten Hefezellen von 1 ml Hefekultur werden in 100 μl Lysepuffer (10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 / 1 mM DTT / 1 mM EDTA / 1 mM PMSF) resuspendiert und ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben. Die Zellsuspension wird für 30 sec gevortext und anschließend 30 sec auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wird achtmal wiederholt, damit die Zellen komplett lysiert sind. Zelltrümmer und unlösliche Komponeten werden im Anschluß bei 20000 x g und 4 °C für 30 min abzentrifugiert. Der cytosolische Überstand wird abgenommen und für weitere Analysen verwendet. Das Pellet wird in 100 μl Lysepuffer resuspendiert und den gleichen Analysen unterzogen. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. Man beachte den übernommenen Verweis "s. 2.2.6.3", im ersten Satz. Dieses Unterkapitel existiert in der untersuchten Arbeit gar nicht. |
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