Charakterisierung funktioneller Aminosäuren der UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosaminkinase
von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 043 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:50:16 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 43, Zeilen: 1-12 |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 58, Zeilen: 16-29 |
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| [Radioaktiver UDP-GlcNAc-2-]Epimerase-Assay: Beim radioaktiven Assay werden zusätzlich zu den Komponenten des nichtradioaktiven UDP-GlcNAc-2-Epimerase- Assays 1 12,5 nCi UDP-[14C]-GlcNAc in den Enzymreaktionsansatz gegeben. In der Regel wird die Enzymreaktion für 30 min bei 37 °C inkubiert, anschließend werden 350 μl Ethanol zugegeben, wodurch die Proteine denaturiert werden, d.h. die Reaktion gestoppt wird. Das entstandene 14C-ManNAc wird durch absteigende Papierchromatographie von UDP-[14C]-GlcNAc abgetrennt. Die Proben werden auf Whatman 3MMChr-Chromatographiestreifen (Herolab, Deutschland) von 2 x 48 cm aufgetragen. Die Chromatographie wird für 16-20 h mit 70% 1-Propanol / 100 mM Natriumacetat, pH 5,0, durchgeführt. Die getrockneten Chromatographiestreifen werden anschließend in 2,5 cm lange Stücke geschnitten und die Radioaktivität mit 5 ml Ultima Gold XR (Packard, Niederlande) in einem Tri-Carb 1900 CA Flüssigszintillationszähler (Packard, Niederlande) bestimmt. Der Rf- Wert für UDP-GlcNAc und ManNAc beträgt unter diesen Bedingungen 0,08 bzw. 0,55. | Radioaktiver UDP-GlcNAc-2-Epimerase-Assay: Beim radioaktiven Assay werden zusätzlich zu den Komponenten des nichtradioaktiven UDP-GlcNAc-2-Epimerase- Assays 1 12,5 nCi UDP-[14C]-GlcNAc in den Enzymreaktionsansatz gegeben. In der Regel wird die Enzymreaktion für 30 min bei 37 °C inkubiert, anschließend werden 350 μl Ethanol zugegeben, wodurch die Proteine denaturiert werden, d.h. die Reaktion gestoppt wird. Das entstandene 14C-ManNAc wird durch absteigende Papierchromatographie von UDP-[14C]-GlcNAc abgetrennt. Die Proben werden auf Whatman 3MMChr-Chromatographiestreifen (Herolab, Deutschland) von 2 x 48 cm aufgetragen. Die Chromatographie wird für 16-20 h mit 70% (v/v) 1-Propanol / 100 mM Natriumacetat, pH 5,0 durchgeführt. Die getrockneten Chromatographiestreifen werden anschließend in 2,5 cm lange Stücke geschnitten und die Radioaktivität mit 5 ml Ultima Gold XR (Packard, Niederlande) in einem Tri-Carb 1900 CA Flüssigszintillationszähler (Packard, Niederlande) bestimmt. Der Rf-Wert für UDP-GlcNAc und ManNAc beträgt unter diesen Bedingungen 0,08 bzw. 0,55. |
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Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140831135825
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