von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 040 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:58:03 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 40, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 40, Zeilen: 44: 20ff; 45: 1ff |
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| 6.2.2.2. Transformation von Plasmid-DNA in S. cerevisiae
Als Transformation wird die Aufnahme von Fremd-DNA und somit die genetische Veränderung von Organismen bezeichnet. Die S. cerevisiae-Zellen werden mittels der von M. Pein modifizierten Gefriermethode von R.J. Dohmen et. al. (1991) transformiert. Dafür werden die gefrorenen kompetenten S. cerevisiae-Zellen mit 2,5 μg Plasmid-DNA versetzt. Alle Ansätze werden 5 min bei 37 °C geschüttelt, mit 1,2 ml 40% (v/v) PEG 3350 (Sigma) / 200 mM Tricin- NaOH, pH 8,4, gemischt und ohne weiteres Schütteln 1 h bei 30 °C inkubiert. Nach Sedimentation bei 13000 x g für 5 sec werden die Zellen zweimal mit je 1 ml 0,15 M NaCl / 10 mM Tricin-NaOH, pH 8,4, gewaschen, anschließend in 200 μl 0,15 M NaCl/10 mM Tricin- NaOH, pH 8,4, aufgenommen, auf Agar-Platten mit Minimalmedium ausplattiert und etwa 4 Tage bis zum Erscheinen von Kolonien bei 30 °C inkubiert. Von den erhaltenen Transformanten werden einzelne Klone als Strichkolonien auf Agar-Platten mit Minimalmedium subkultiviert und für die beschriebenen Experimente eingesetzt. 6.2.2.3. Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen Um die optimalen Bedingungen für eine maximale Expression von rekombinantem Protein zu ermitteln, werden zunächst Pilotexpressionen durchgeführt. Einzelne Klone werden in 5 ml Minimalmedium bis zur Sättigung bei 30 °C kultiviert. Mit 500 μl dieser Vorkultur werden 50 ml Minimalmedium beimpft und bis zu einer OD600 von 1 bei 30 °C kultiviert. Durch Zugabe von 2% (w/v) Galactose wird die Proteinexpression induziert. Um die optimalen Bedingungen für maximale Expression von rekombinantem Protein zu ermitteln, werden zu verschiedenen Zeitpunkten jeweils 5 ml Aliquots abgenommen, die OD600 ermittelt und die Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 x g und 4 °C pelletiert. Der Medienüberstand und die Zellen werden bis zur weiteren Analyse bei -70 °C gelagert, wobei die Zellen zuvor noch mit 500 μl Wasser gewaschen werden. Die gefrorenen Zellen werden in Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM DTT / 1 mM PMSF) resuspendiert, so daß eine berechnete OD600 von 50-100 eingestellt wird. Anschließend wird ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben. Die Zellsuspension wird für 30 sec gevortext und anschließend 30 sec auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wird siebenmal wiederholt, damit die Zellen komplett lysiert sind. Zelltrümmer und unlösliche Komponenten [werden im Anschluß bei 20000 x g und RT für 10 min abzentrifugiert.] |
2.2.3.2 Transformation von Plasmid-DNA in Saccharomyces cerevisiae
Als Transformation wird die Aufnahme von Fremd-DNA und somit die genetische Veränderung von Organismen bezeichnet. Die S. cerevisiae-Hefezellen werden mittels der von M. von Pein modifizierten Gefriermethode von R.J. Dohmen et. al. (1991) transformiert. Dafür werden die gefrorenen kompetenten S. cerevisiae-Hefezellen mit 2,5 μg Plasmid-DNA versetzt. Alle Ansätze werden 5 min bei 37 °C geschüttelt, mit 1,2 ml 40% (v/v) PEG 3350 (Sigma) / 200 mM Tricine-NaOH, pH 8,4 gemischt und ohne weiteres Schütteln 1 h bei 30 °C inkubiert. Nach Sedimentation bei 13000 x g für 5 sec werden die Zellen zweimal mit je 1 ml 0,15 M NaCl / 10 mM Tricine-NaOH, pH 8,4 gewaschen, anschließend in 200 μl 0,15 M NaCl / 10 mM Tricine-NaOH, pH 8,4 aufgenommen, auf Agar-Platten mit Minimalmedium ausplattiert und etwa 4 Tage bis zum Erscheinen von Kolonien bei 30 °C inkubiert. Von den erhaltenen Transformanten werden einzelne Klone als Strichkolonien auf Agar-Platten mit Minimalmedium subkultiviert und für die beschriebenen Experimente eingesetzt. [Seite 45] 2.2.3.3 Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen Um die optimalen Bedingungen für eine maximale Expression von rekombinantem Protein zu ermitteln, werden zunächst Pilotexpressionen durchgeführt. Einzelne Klone werden in 5 ml Minimalmedium bis zur Sättigung bei 30 °C kultiviert. Mit 500 μl dieser Vorkultur werden 50 ml Minimalmedium beimpft und bis zu einer OD600 von 1 bei 30 °C kultiviert. Durch Zugabe von 2% (w/v) Galactose wird die Proteinexpression induziert. Um die optimalen Bedingungen für maximale Expression von rekombinantem Protein zu ermitteln, werden zu verschiedenen Zeitpunkten jeweils 5 ml Aliquots abgenommen, die OD600 ermittelt und die Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 x g und 4 °C pelletiert. Der Medienüberstand und die Zellen werden bis zur weiteren Analyse bei -70 °C gelagert, wobei die Zellen zuvor noch mit 500 μl Wasser gewaschen werden. Die gefrorenen Zellen werden in Lysepuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5 / 1 mM EDTA / 1 mM DTT / 1 mM PMSF) resuspendiert, so daß eine berechnete OD600 von 50-100 eingestellt wird. Anschließend wird ein gleiches Volumen an „acid-washed 0,5 mm glass beads“ (Sigma, Deutschland) zugegeben. Die Zellsuspension wird für 30 sec gevortext und anschließend 30 sec auf Eis inkubiert. Dieser Vorgang wird siebenmal wiederholt, damit die Zellen komplett lysiert sind. Zelltrümmer und unlösliche Komponenten werden im Anschluß bei 20000 x g und RT für 10 min abzentrifugiert. |
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