von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 037 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:43:21 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 37, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 40, 41, Zeilen: 40: 14ff; 41: 1ff |
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| 6.2.1.9. Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Kompetente Zellen sind Zellen, die fähig sind, freie, zirkuläre DNA aufzunehmen. Durch Behandlung mit CaCl2 wird die Zellmembran für DNA-Moleküle durchlässig (Dagert und Ehrlich, 1979). Zur Herstellung von kompetenten Zellen werden 2 ml LBMedium mit einer Einzelkolonie von Inv/F' angeimpft und bei 37 °C bis zur Sättigung kultiviert. 1 ml dieser Vorkultur wird in 100 ml LB überimpft und bis zu einer OD600 von 0,2-0,3 angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (3000 x g, 5 min, 4 °C) sedimentiert und in 20 ml kaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wird 5 min bei 3000 x g und 4 °C zentrifugiert, das Zellpellet in 1 ml kaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert und nochmals für mindestens 1 h auf Eis inkubiert. Die Zellen werden direkt zur Transformation eingesetzt oder nach Zugabe von 20% (v/v) Glycerin bei –80 °C gelagert. 6.2.1.10. Transformation von Plasmid-DNA in Escherichia coli Als Transformation wird die Aufnahme von Fremd-DNA und somit die genetische Veränderung von Bakterien bezeichnet. Dabei wird zu 100 μl kompetenten Zellen der Ligationsansatz oder etwa 100 ng Plasmid-DNA pipettiert und vorsichtig gemischt. Die Proben werden anschließend 30 min auf Eis inkubiert. Durch die nachfolgende 45-sec- Inkubation bei 42 °C im Wasserbad wird die Aufnahme der DNA durch die Bakterienzellen erleichtert. Die Zellen werden anschließend nochmals 2 min auf Eis inkubiert und danach in 250 μl LB-Medium oder alternativ SOC-Medium für 1 h schüttelnd bei 37 °C inkubiert, damit sich die Bakterienzellen regenerieren können. Aliquots von 50 bis 200 μl werden auf vorgewärmten Agarplatten mit Selektivmedium ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. 6.2.1.11. Sequenzanalyse Zur Kontrolle von Klonierungsschritten und zur Sequenzanalyse generell werden Sequenzierungen durchgeführt. Alle Sequenzierungen werden nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1992) durchgeführt. Bei der Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Sequenzierprimern werden 4 pmol Sequenzierprimer mit 1,2 μg DNA auf vier Nukleotidmixe („Thermo SequenaseTM Primer Cycle Sequencing Kit“; Amersham, Deutschland) verteilt und die [Ansätze mit einem Gesamtvolumen von 6 μl einem Cycle-Sequencing mit 25 Zyklen (20 sec 95°C / 20 sec 60 °C / 10 sec 72°C) unterzogen.] |
2.2.1.10 Herstellung kompetenter Escherichia coli-Zellen
Kompetente Zellen sind Zellen, die fähig sind, freie, zirkuläre DNA aufzunehmen. Durch Behandlung mit CaCl2 wird die Zellmembran für DNA-Moleküle durchlässig (Dagert und Ehrlich, 1979). Zur Herstellung von kompetenten Zellen werden 2 ml LBMedium mit einer Einzelkolonie von InvαF' oder BL21 StarTM(DE3)pLysS angeimpft und bei 37 °C bis zur Sättigung kultiviert. 1 ml dieser Vorkultur wird in 100 ml LB überimpft und bis zu einer OD600 von 0,2-0,3 angezogen. Die Zellen werden durch Zentrifugation (3000 x g, 5 min, 4 °C) sedimentiert und in 20 ml kaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wird 5 min bei 3000 x g und 4 °C zentrifugiert, das Zellpellet in 1 ml kaltem 100 mM CaCl2 resuspendiert und nochmals für mindestens 1 h auf Eis inkubiert. Die Zellen werden direkt zur Transformation eingesetzt oder nach Zugabe von 20% (v/v) Glycerin bei –80 °C gelagert. 2.2.1.11 Transformation von Plasmid-DNA in Escherichia coli Als Transformation wird die Aufnahme von Fremd-DNA und somit die genetische Veränderung von Bakterien bezeichnet. Dabei wird zu 100 μl kompetenten Zellen der Ligationsansatz oder etwa 100 ng Plasmid-DNA pipettiert und vorsichtig gemischt. Die Proben werden anschließend 30 min auf Eis inkubiert. Durch die nachfolgende 45-sec- Inkubation bei 42 °C im Wasserbad wird die Aufnahme der DNA durch die Bakterienzellen erleichtert. Die Zellen werden anschließend nochmals 2 min auf Eis inkubiert und danach in 250 μl LB-Medium oder alternativ SOC-Medium für 1 h schüttelnd bei 37 °C inkubiert, damit sich die Bakterienzellen regenerieren können. Aliquots von 50 bis 200 μl werden auf vorgewärmten Agarplatten mit Selektivmedium ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. [Seite 41] 2.2.1.12 Sequenzierungen Zur Kontrolle von Klonierungsschritten und zur Sequenzanalyse generell werden Sequenzierungen durchgeführt. Alle Sequenzierungen werden nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1992) durchgeführt. Bei der Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Sequenzierprimern werden 4 pmol Sequenzierprimer mit 1,2 μg DNA auf vier Nukleotidmixe („Thermo SequenaseTM Primer Cycle Sequencing Kit“; Amersham, Deutschland) verteilt und die Ansätze mit einem Gesamtvolumen von 6 μl einem Cycle-Sequencing mit 25 Zyklen (20sec 95°C / 20 sec 60 °C / 10sec 72°C) unterzogen. |
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