von Heinrich Wieland
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[1.] Hw/Fragment 035 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:40:08 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, KomplettPlagiat, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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Untersuchte Arbeit: Seite: 35, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 38, 39, Zeilen: 38: 18f - 39:1ff |
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[Ein Reaktionsansatz enthält zwischen 1 und 40 μg DNA. Pro Restriktionsansatz] werden etwa eine Einheit (U) Enzym pro μg DNA eingesetzt. Anschließend werden die erhaltenen Fragmente mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
6.2.1.5. Agarose-Gelelektrophorese Mit der Agarose-Gelelektrophorese können DNA-Moleküle nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer DNA-Moleküle ist dabei umgekehrt propotional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Bei ringförmiger DNA können auch coiled- und supercoiled-Strukturen auftreten, welche aufgrund ihrer höheren Kompaktheit schneller wandern und in den Gelen deshalb bei scheinbar kleineren Molekulargewichten detektiert werden. Mit Agarosegelen können DNA-Moleküle im Bereich von 500-8000 bp identifiziert werden. Agarose-Gelelektrophoresen werden zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten nach Restriktionsspaltung, zur Isolierung von DNA-Fragmenten und zur Qualitätskontrolle von DNA verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in horizontalen 0,8 bis 1,5%igen (w/v) Agarose-Gelen. Die Agarose wird durch Kochen in TAE-Puffer (40 mM Tris-HCl / 5 mM Natriumacetat / 1 mM EDTA, pH 7,9) gelöst und in die entsprechenden Gelschlitten gegossen. Nach dem Abkühlen und Erstarren der Agarose wird das Gel in die mit TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Die Proben werden vor dem Auftragen mit 1/5 Volumen Bromphenolblau-Probenpuffer (20% (w/v) Ficoll 400 / 1% (w/v) SDS / 0,02% (w/v) Bromphenolblau in TAE-Puffer) versetzt. Das Auftragsvolumen beträgt etwa 5-20 μl pro Probentasche. Als Größenstandard werden 10 μl des 1 kb-DNA-Markers (Gibco- BRL, USA) aufgetragen. Die Elektrophorese wird anschließend bei 0,5 V / cm2 durchgeführt, bis der Farbmarker die gewünschte Laufstrecke zurückgelegt hat. Das Gel wird dann für 5-10 min in einem Ethidiumbromidbad (0,5 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer) inkubiert und die DNA unter UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht. 6.2.1.6. Isolierung von DNA-Fragmenten mittels Gelelution DNA kann aus Agarose-Gelen durch Verflüssigung der Agarose in Spezialpuffer herausgelöst und anschließend über QIAgen-Säulen des „QlAquick Gel Extraction Kits“ (Qiagen, Deutschland) gereinigt werden. Der im Kit enthaltene Puffer QG ermöglicht das Schmelzen der Agarose bei relativ niedrigen Temperaturen. |
Ein Reaktionsansatz enthält zwischen 1 und 40 μg DNA. Pro Restriktionsansatz werden etwa eine Einheit (U) Enzym pro μg DNA eingesetzt. Anschließend werden die erhaltenen Fragmente mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
2.2.1.6 Agarose-Gelelektrophorese Mit der Agarose-Gelelektrophorese können DNA-Moleküle nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer DNA-Moleküle ist dabei umgekehrt propotional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Bei ringförmiger DNA können auch coiled und supercoiled-Strukturen auftreten, welche aufgrund ihrer höheren Kompaktheit schneller wandern und in den Gelen deshalb bei scheinbar kleineren Molekulargewichten detektiert werden. Mit Agarosegelen können DNA-Moleküle im Bereich von 500-8000 bp identifiziert werden. Agarose-Gelelektrophoresen werden zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten nach Restriktionsspaltung, zur Isolierung von DNA-Fragmenten und zur Qualitätskontrolle von DNA verwendet. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in [Seite 39] horizontalen 0,8 bis 1,5%igen (w/v) Agarose-Gelen. Die Agarose wird durch Kochen in TAE-Puffer (40 mM Tris / 5 mM Natriumacetat / 1 mM EDTA, pH 7,9) gelöst und in die entsprechenden Gelschlitten gegossen. Nach dem Abkühlen und Erstarren der Agarose wird das Gel in die mit TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Die Proben werden vor dem Auftragen mit 1/5 Volumen Bromphenolblau-Probenpuffer (20% (w/v) Ficoll 400 / 1% (w/v) SDS / 0,02% (w/v) Bromphenolblau in TAE-Puffer) versetzt. Das Auftragsvolumen beträgt etwa 5-20 μl pro Probentasche. Als Größenstandard werden 10 μl des 1 kb-DNA-Markers (Gibco-BRL, USA) aufgetragen. Die Elektrophorese wird anschließend bei 0,5 V / cm2 durchgeführt, bis der Farbmarker die gewünschte Laufstrecke zurückgelegt hat. Das Gel wird dann für 5-10 min in einem Ethidiumbromidbad (0,5 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer) inkubiert und die DNA unter UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht. 2.2.1.7 Isolierung von DNA-Fragmenten mittels Gelelution DNA kann aus Agarose-Gelen durch Verflüssigung der Agarose in Spezialpuffer herausgelöst und anschließend über QIAgen-Säulen des „QlAquick Gel Extraction Kits“ (Qiagen, Deutschland) gereinigt werden. Der im Kit enthaltene Puffer QG ermöglicht das Schmelzen der Agarose bei relativ niedrigen Temperaturen. |
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