von Heinrich Wieland
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| [1.] Hw/Fragment 020 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-31 12:31:45 Schumann | Blume 2003, Fragment, Gesichtet, Hw, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 20, Zeilen: 1-26 |
Quelle: Blume 2003 Seite(n): 78, 79, Zeilen: 78: 24ff - 79: 1ff |
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| Der pYES2/lacZ-Vektor enthält das lacZ-Gen, das für die β-Galactosidase codiert, ein Enzym, das von verschiedenen Galactosederivaten hydrolytisch Galactose abspaltet. Die Aktivität dieses Enzyms kann in einem β-Gal-Assay nachgewiesen werden. In den mit dem pYES2/lacZ-Vektor transformierten Hefen konnte mit diesem Assay β-Galactosidase-Aktivität detektiert werden. Gleichzeitig wurden mittels Morgan- Elson-Test in den mit pYES2/2epi transformierten Hefen UDP-GlcNAc-2-Epimerase- Aktivitäten nachgewiesen. Damit läßt sich die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase auch in S. cerevisiae als aktives Protein exprimieren. Um die maximale Proteinausbeute in Abhängigkeit von der Galactose-Induktion zu ermitteln, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Aliquots der Hefezellen geerntet und auf UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase bzw. β-Galactosidase untersucht. Werden jeweils die gemessenen Enzymaktivitäten auf die Proteinmengen bezogen, d.h. die spezifischen Enzymaktivitäten ermittelt, so läßt sich kein Zusammenhang zwischen der Galactose-Induktionszeit und der jeweiligen spezifischen Enzymaktivität erkennen. Nach einer sechsstündigen Galactose-Inkubation konnte eine geringfügig höhere Enzymkonzentration detektiert werden als zu den anderen Zeitpunkten. Aus den jeweiligen Aktivitätsbestimmungen konnte die Menge an überexprimiertem löslichem Protein pro Liter Hefekultur ermittelt werden. Da keine Relation zwischen der Zeit der Galactose-Induktion und der spezifischen Aktivität der Enzyme beobachtet wurde, wurde dieser Wert exemplarisch für t = 6 h ermittelt, wo die jeweiligen Kulturen eine OD600 von etwa 3 hatten. Für die β-Galactosidase lag dieser Wert bei etwa 90 μg/L Kultur und für die UDPGlcNAc- 2-Epimerase/ManNAc-Kinase bei etwa 34 μg/L Kultur. Die Firma Invitrogen gibt für die Expression von Proteinen in pYES-Systemen Werte von 0,1-100 mg/L an. Die Proteinexpression ist somit unter sub-optimalen Expressionsbedingungen durchgeführt worden, da die für die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase erzielten Proteinmengen mit 34 μg/L weit unter den erwarteten Werten von mindestens 100 μg/L liegt und dieser Wert auch nicht mit der β-Galactosidase erzielt wurde. | Der pYES2/lacZ-Vektor enthält das lacZ-Gen, das für die β-Galactosidase codiert, ein Enzym, das von verschiedenen Galactosederivaten hydrolytisch Galactose abspaltet. Die Aktivität dieses Enzyms kann in einem β-Gal-Assay nachgewiesen werden. In den mit dem pYES2/lacZ-Vektor transformierten Hefen konnte mit diesem Assay β-Galactosidase-Aktivität detektiert werden. Gleichzeitig wurden mittels Morgan- Elson-Test in den mit pYES2/2epi transformierten Hefen UDP-GlcNAc-2-Epimerase- Aktivitäten nachgewiesen. Damit läßt sich die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc- Kinase auch in der Hefe S. cerevisiae als aktives Protein exprimieren.
Um die maximale Proteinausbeute in Abhängigkeit von der Galactose-Induktion zu ermitteln, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Aliquots der Hefezellen geerntet und auf UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase bzw. β-Galacotsidase untersucht. Werden jeweils die gemessenen Enzymaktivitäten auf die Proteinmengen bezogen, d.h. die spezifischen Enzymaktivitäten ermittelt, so läßt sich kein Zusammenhang zwischen der Galactose-Induktionszeit und der jeweiligen spezifischen Enzymaktivität erkennen. [Seite 79] Nach einer sechsstündigen Galactose-Inkubation konnte eine geringfügig höhere Enzymmenge detektiert werden als zu den anderen Zeitpunkten. Im SDS-Polyacrylamidgel konnte jedoch zu keinem Zeitpunkt β-Galactosidase bzw. UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase nachgewiesen werden. Aus den jeweiligen Aktivitätsbestimmungen konnte die Menge an überexprimiertem löslichem Protein pro Liter Hefekultur ermittelt werden. Da keine Relation zwischen der Zeit der Galactose-Induktion und der spezifischen Aktivität der Enzyme beobachtet wurde, wurde dieser Wert exemplarisch für t = 6 h ermittelt, wo die jeweiligen Kulturen eine OD600 von etwa 3 hatten. Für die β-Galactosidase lag dieser Wert bei etwa 90 μg/l Kultur und für die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase bei etwa 34 μg/l Kultur. Die Firma Invitrogen gibt für die Expression von Proteinen in pYES-Systemen Werte von 0,1-100 mg/l an. Für das lacZ-Gen gibt es Angaben für den Genestorm- Kontrollvektor pYES/GS. In diesem Vektor liegt die Expressionsrate für die β-Galactosidase bei 10-15 μg/l/OD600. Die erzielte Expression von 30 μg/l/OD600 β-Galactosidase liegt damit etwa doppelt so hoch wie die Erwartungswerte. Die Proteinexpression ist somit unter optimalen Expressionsbedingungen durchgeführt worden; jedoch liegen die für die UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase erzielten Proteinmengen mit 34 μg/l weit unter den erwarteten Werten von mindestens 100 μg/l. |
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