von Dr. Florian Freese
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| [1.] Flf/Fragment 036 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-08-18 01:27:20 Graf Isolan | Flf, Fragment, Freese 2010, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 36, Zeilen: 1ff (komplett) |
Quelle: Freese 2010 Seite(n): 45, 46, Zeilen: 45: 1ff; 46: 1-16 |
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| 3.2.2.5.2.1 Primer- und Sondendesign
Um aus der extrahierten RNA die gewünschten Abschnitte amplifizieren zu können, müssen zunächst die für die Sequenz spezifische Sonde und die dazu passenden Primerpaare für die jeweilige Sequenz entworfen werden. Die Sequenz wird dazu zunächst einem sogenannten alignment unterzogen, d.h., mit allen bekannten Sequenzen des Genoms verglichen. Erst wenn sich keine Überschneidungen zeigen, kann sicher mit der ausgesuchten Sequenz gearbeitet werden. Es werden für die Methode der Taq-Man-PCR die Sonde sowie jeweils zwei Primerpaare benötigt: ein internes, nah an der Sequenz liegendes Paar, und ein externes, weiter entfernt liegendes Paar. Da diese Primer für die Methode spezifische Voraussetzungen erfüllen müssen, wird ein Softwareprogramm, Primer Express® (Tutorial for Real Time Quantitative PCR Primer and Probe Design, Applied Biosystems Real Time Quantitative PCR systems (7700, 5700), Foster City, USA), zum Design dieser Primer genutzt. Zur Herstellung von TaqMan-Sonden sollten folgende Regeln beachtet werden: Der G-C–Gehalt sollte zwischen 30-80% betragen. Aneinanderreihungen identischer Nukleotide sollten vermieden werden. Dies gilt besonders für vier und mehr Guanin. Aneinanderreihungen. Des Weiteren sollte kein Guanin am 5´-Ende erscheinen. Schließlich sollte der Strang mit einem höheren Cytosin als Guanin Anteil als Sonde ausgewählt werden. Für Einzelsondenansätze bei Einsatz des Primer Express®-Programms sollte die Schmelztemperatur (Tm) mit 68°-70° gewählt werden. Ähnlich erfolgt die Herstellung von Taq-Man-Primern Die Primer werden nach der Sonde ausgewählt. Man wählt die Primer in größtmöglicher Nähe zu der Sonde, ohne diese zu überlappen. Der G-C-Gehalt sollte ebenfalls zwischen 30-80% liegen. Aneinanderreihungen identischer Nukleotide sind zu vermeiden. Das Auftreten von mehr als vier Guaninnukleotiden sollte ebenfalls vermieden werden. Beim Anwenden der Primer Express®-Software sollte die Temperatur auf 58°C-60°C gelegt werden. Die fünf Nukleotide am 3´-Ende sollten nicht mehr als zwei Guanin- und/oder Cytosin-Basen enthalten. |
Primer- und Sondendesign
Um aus der extrahierten RNA die gewünschten Abschnitte amplifizieren zu können, müssen zunächst die für die Sequenz spezifische Sonde und die dazu passenden Primerpaare für die jeweilige Sequenz entworfen werden. Die Sequenz wird dazu zunächst einem sogenannten alignment unterzogen, d.h., mit allen bekannten Sequenzen des Genoms verglichen. Erst wenn sich keine Überschneidungen zeigen, kann sicher mit der ausgesuchten Sequenz gearbeitet werden. Es werden für die Methode der Taqman-PCR die Sonde sowie jeweils zwei Primerpaare benötigt: ein internes, nah an der Sequenz liegendes Paar, und ein externes, weiter entfernt liegendes Paar. Da diese Primer für die Methode spezifische Vorraussetzungen erfüllen müssen, wird ein Softwareprogramm, Primer Express®, Tutorial for Real Time Quantitative PCR Primer and Probe Design, Applied Biosystems Real Time Quantitative PCR systems (7700, 5700), Foster City, USA, zum Design dieser Primer genutzt. [Seite 46] Das TaqMan-Sondendesign muß dabei nach folgenden Regeln erfolgen: Der G-C–Gehalt sollte zwischen 30-80% betragen. Aneinanderreihungen identischer Nukleotide sollten vermieden werden. Dies gilt besonders für Guanin. Aneinanderreihungen von vier oder mehr Guaninen sollten vermieden werden. Weiterhin sollte kein Guanin am 5´-Ende erscheinen. Schließlich sollte der Strang mit mehr Cytosin als Guanin als Sonde ausgewählt werden. Für Einzelsondenansätze bei Einsatz des Primer Express®-Programms sollte die Schmelztemperatur (Tm) mit 68°-70° gewählt werden. Die Taq-Man-Primer werden wie folgt gewählt: Die Primer werden nach der Sonde ausgewählt. Man wählt die Primer in größtmöglicher Nähe zu der Sonde, ohne diese zu überlappen. Der G-C-Gehalt sollte zwischen 30-80% liegen. Auch hier sollten Aneinanderreihungen identischer Nukleotide vermieden werden, wiederum besonders bei Guanin. Mehr als vier Guanine hintereinander sollten nicht auftreten. Beim Anwenden der Primer Express®-Software sollte die Temperatur 58°C-60°C betragen. Die fünf Nukleotide am 3´-Ende sollten nicht mehr als zwei Guanin- und/oder Cytosin-Basen enthalten. |
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