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| Untersuchte Arbeit: Seite: 40, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 73, 74, Zeilen: 73: 17 ff.; 74: 1 ff. |
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| In autologen und allogenen Testsystemen sollte die Kapazität RNA-infizierter DCs untersucht werden die Proliferation von T-Zellen zu induzieren.
Die Vorbereitung ist bei allogenen und autologen MLR identisch: Aus frischem Spenderblut isolierte PBL wurden zur Aufreinigung von T-Zellen verwendet. Dazu wurde das MACS Pan T Cell Isolation Kit der Firma Miltenyi Biotec verwendet. Nach der Isolation der PBL über den Ficoll Gradienten wurden die Zellen gewaschen und gezählt. Jeweils 1x107 Zellen wurden in 80μl MACS-Puffer aufgenommen und mit 20μl des Hapten-Antibody-Cocktail (enthält eine Mixtur aus monoklonalen haptenkonjugierten Antikörpern: CD11b, CD19, CD36 und CD56) vermischt und bei 6-12°C in einem Eis-Wassergemisch für 10 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 2 mal mit MACS-Puffer gewaschen und anschließend erneut in 80μl MACS-Puffer aufgenommen und mit 20μl der MACS Anti-Hapten Microbeads (enthält magnetische Teilchen, die an monoklonale anti-Hapten Antikörper gebunden sind) versetzt und gut durchmischt. Die Zellsuspension wurde dann für weitere 15 min bei 6-12°C in dem Eis-Wassergemisch inkubiert. Danach wurden die Zellen 1 mal gewaschen und in einem Volumen von 500μl MACS-Puffer aufgenommen. Zur T-Zell-Depletion wurden mit feiner Stahlwolle (oder Kügelchen) gefüllte LS+/VS+-Säulen an einem Magneten (MidiMACS, VarioMACS oder SuperMACS) befestigt und mit 3 ml MACS-Puffer befeuchtet. Anschließend wurde die Zellsuspension auf die Säule gegeben und die durchlaufende Fraktion in einem Röhrchen gesammelt. Alle Zellen, die nicht den T-Zellen entsprachen, blieben aufgrund der Markierung mit den Antikörper-Microbeads in der Säule hängen, während die unmarkierte negative Fraktion hochangereicherte CD3+ T-Zellen enthielt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an separierten T-Zellen von der Säule zu gewinnen, wurde diese noch viermal mit 3 ml MACS-Puffer gewaschen. Die Eluate wurden vereinigt, zentrifugiert, noch einmal mit PBS gewaschen und schließlich in einem entsprechenden Volumen von komplettem Medium aufgenommen, gezählt und für weitere Analyse weiterverwendet. Die Reinheit der T-Zellen wurde durch Markierung mit einem anti-CD3-Antikörper in der Durchflusszytometrie evaluiert. Für den Ansatz in der MLR wurden die T-Zellen auf 1x106/ml eingestellt und pro 100μl in 96-Well-Rundbodenplatten gesät. |
In autologen und allogenen Testsystemen sollte die Kapazität AdV-infizierter DCs und LCLs untersucht werden die Proliferation von T-Zellen zu induzieren. Aus frischem Spenderblut isolierte PBL wurden zur Aufreinigung von T-Zellen verwendet. Dazu wurde das MACS Pan T Cell Isolation Kit der Firma Miltenyi Biotec verwendet. Nach der Isolation der PBL über den Ficoll Gradienten wurden die Zellen gewaschen und gezählt. Jeweils 1x107 Zellen wurden in 80μl MACS-Buffer aufgenommen und mit 20μl des Hapten-Antibody-Cocktail (enthält eine Mixtur aus monoklonalen haptenkonjugierten Antikörpern: CD11b, CD19, CD36 und CD56) vermischt und bei 6-12°C in einem Eis-Wassergemisch für 10 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 2 mal mit MACS-Buffer gewaschen und anschließend erneut in 80μl MACS-Buffer aufgenommen und mit 20μl der MACS Anti-Hapten Microbeads (enthält magnetische Teilchen, die an monoklonale anti-Hapten Antikörper gebunden sind) versetzt und gut durchmischt. Die Zellsuspension wurde dann für weitere 15 min bei 6-12°C in dem Eis-Wassergemisch inkubiert. Danach wurden die Zellen 1 mal gewaschen und in einem Volumen von 500μl MACS-Buffer aufgenommen.
Zur T-Zell-Depletion wurden mit feiner Stahlwolle (oder Kügelchen) gefüllte LS+/VS+-Säulen an einem Magneten (MidiMACS, VarioMACS oder SuperMACS) befestigt und mit 3 [Seite 74] ml MACS-Buffer befeuchtet. Anschließend wurde die Zellsuspension auf die Säule gegeben und die durchlaufende Fraktion in einem Röhrchen gesammelt. Alle Nicht T-Zellen blieben aufgrund der Markierung mit den Antikörper-Microbeads in der Säule hängen, während die unmarkierte negative Fraktion hochangereicherte CD3+ T-Zellen enthielt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an separierten T-Zellen von der Säule zu gewinnen wurde diese noch viermal mit 3 ml MACS-Buffer gewaschen. Die Eluate wurden vereinigt, zentrifugiert, noch einmal mit PBS gewaschen und schließlich in einem entsprechenden Volumen von komplettem Medium aufgenommen, gezählt und für weitere Analyse weiterverwendet. Die Reinheit der T-Zellen wurde durch Markierung mit einem anti-CD3-Antikörper in der FACS-Analyse evaluiert. Für den Ansatz in der MLR wurden die T-Zellen auf 1x106/ml eingestellt und pro 100μl in 96-Well-Rundbodenplatten gesät. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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