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| Untersuchte Arbeit: Seite: 35, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 66, 67, Zeilen: 66: 1 ff.; 67: 3 ff. |
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| [Daher kann eine] große Menge von verschiedenen Liganden gebunden und aufgenommen werden, bei einer relativ niedrigen Menge an Rezeptoren.
FITC-konjugiertes Dextran (MW:70000) wurde mit serumfreien Medium zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt. DCs wurden in einer Konzentration von 1x105 pro Test in 100 μl X-VIVO 15 eingestellt und mit 100 μl der FITC-Dextranlösung versetzt. Das Gesamtvolumen betrug dabei 200 μl und wurde bei 37 °C inkubiert. Es wurden doppelte Testansätze vorbereitet und bei einer Kinetik von 30-180 Min. wurden die Zellen aus dem Inkubator entnommen und 2 x mit kaltem PBS gewaschen und in 500 μl FACS-Puffer aufgenommen und die Menge an aufgenommene FITC-Dextran im FACS Gerät gemessen. Unbehandelte DCs dienten dabei als Negativkontrolle. DURCHFLUßZYTOMETRISCHE ANALYSEN Der Fluoreszenzaktivierte Zellsorter (fluorescence-activated cell sorter = FACS ) kann nicht nur Zellen nach Größe und Granularität einordnen, sondern auch zählen und gemäß ihrer Oberflächenmarkierung auftrennen und quantifizieren. Monoklonale Antikörper gegen verschiedene Oberflächenproteine werden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, um bestimmte Zellen in einer gemischten Population detektieren zu können. Das Gemisch der markierten Zellen wird angesaugt und anschließend durch eine Kapillare gedrückt. Dadurch entsteht ein feiner Flüssigkeitsstrahl mit vereinzelten Zellen, die sich in bestimmten Abständen befinden. Dieser Flüssigkeitsstrahl passiert einen Laserstrahl, dabei kommt es an den Zellen zu einer Lichtstreuung und die Farbstoffmoleküle, die über die monoklonalen Antikörper an die Zelle gebunden sind werden zur Fluoreszenz angeregt. Empfindliche Photodetektoren messen sowohl das gestreute als auch das emittierte Licht, wobei ersteres Informationen über Größe und Granularität der Zelle liefert, die Fluoreszenz ermöglicht dagegen Aussagen über die Bindung der monoklonalen Antikörper und damit über die Expression der Oberflächenproteine auf jeder untersuchten Zelle. |
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Daher können eine große Menge von verschiedenen Liganden gebunden und aufgenommen werden, bei einer relativ niedrigen Menge an Rezeptoren. FITC-konjugiertes Dextran (MW:70000) wurde mit serumfreien Medium zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt. DCs wurden in einer Konzentration von 1x105 pro Test in 100 μl X-VIVO 15 eingestellt und mit 100 μl der FITC-Dextranlösung versetzt. Das Gesamtvolumen betrug dabei 200 μl und wurde bei 37 °C inkubiert. Es wurden doppelte Testansätze vorbereitet und bei einer Kinetik von von 30-180 Min. wurden die Zellen aus dem Inkubator entnommen und 2 x mit kaltem PBS gewaschen und in 500 μl FACS-Buffer aufgenommen und die Menge an aufgenommene FITC-Dextran im FACS Gerät gemessen. Unbehandelte DCs dienten dabei als Negativkontrolle. [Seite 66] Durchflußzytometrische-Analyse Der Fluoreszenzaktivierte Zellsorter (fluorescence-activated cell sorter = FACS ) ist ein Gerät, daß [sic] nicht nur Zellen nach Größe und Granularität einordnen kann, sondern auch zählen und gemäß ihrer Oberflächenmarkierung auftrennen und quantifizieren kann. Monoklonale Antikörper gegen verschiedene Oberflächenproteine werden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, um bestimmte Zellen in einer gemischten Population detektieren zu können. Das Gemisch der markierten Zellen wird angesaugt und anschließend durch eine Kapillare gedrückt. Dadurch entsteht ein feiner Flüssigkeitsstrahl mit vereinzelten Zellen, die sich in bestimmten Abständen befinden. Dieser Flüssigkeitsstrahl passiert einen Laserstrahl, dabei kommt es an den Zellen zu einer Lichtstreuung und die Farbstoffmoleküle, die über die monoklonalen Antikörper an die Zelle gebunden sind werden zur Fluoreszenz angeregt. Empfindliche Photodetektoren messen sowohl das gestreute als auch das emittierte Licht, wobei ersteres Informationen über Größe und Granularität der Zelle liefert, die Fluoreszenz ermöglicht dagegen Aussagen über die Bindung der monoklonalen Antikörper und damit über die Expression der Oberflächenproteine auf jeder untersuchten Zelle. |
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