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| Untersuchte Arbeit: Seite: 34, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 64, 66, 67, Zeilen: 64: 1 ff.; 66: letzter Abschnitt; 67: 1 ff. |
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| KULTUR VON DENDRITISCHEN ZELLEN (DCS)
PBL wurden in serumfreien RPMI-1640 in einer Konzentration von 2,5x106 pro ml in 6-Well-Platten ausgesät, mit einer Gesamtzellzahl von 5x106 Zellen pro Well. Die Platten wurden dann für zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach Absetzen der adhärenten Zellfraktion wurde der Überstand vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette von der adhärenten Zellschicht heruntergewaschen, so dass das gesamte Kulturmedium mit den nicht-adhärenten Zellen entfernt wurde, diese wurden für den späteren Gebrauch aufgehoben. Die adhärenten Zellen wurden weiter kultiviert unter Zugabe von 2 ml serumfreien Medium (X-VIVO-15), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin (100 U/ml und 100 μg/ml), sowie 800 IU/ml rekombinantem humanes GM-CSF und 500 IU/ml rekombinantem human IL-4. Nach sieben Tagen in Kultur wurde frisches rhGM-CSF (800 IU/ml) dem Kulturmedium zugegeben und nach 10-12 Tagen Zellkultur [sic] die unreifen DCs geerntet und für weiterführende Experimente verwendet. PHÄNOTYPISCHE ANALYSE VON DCS Zur Charakterisierung von DCs mittels direkter Immunfluoreszenz wurden die folgenden monoklonalen Antikörper verwendet, die entweder mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) direktmarkiert waren: CD-1a (FITC,-oder PE-konjugiert), CD-11c-PE, CD-11a –FITC, CD-123-PE, CD-25-FITC, CD-40 (FITC,-oder PE-konjugiert), CD-80, CD-86, (FITC,-oder PE-konjugiert), CD-51-PE, HLA-ABC und HLA-DR (FITC,-oder PE-onjugiert), CD-19-FITC, CD-83-PE und CD-14-PE BESTIMMUNG DER ENDOZYTOTISCHEN KAPAZITÄT VON DCS Die Mannoserezeptor vermittelte Endozytose stellt experimentell ein Maß dar, für die Fähigkeit DCs Moleküle aufzunehmen, zu prozessieren und zu präsentieren. Aufgrund multipler Kohlenhydratbindungsdomänen des Mannoserezeptors, sind DCs befähigt große Mengen an Glykoproteinen zu binden und zu internalisieren. Im Gegensatz zu Fc-Rezeptoren, die zusammen mit ihren Liganden degradiert werden, entläßt der Mannoserezeptor seine Liganden bei einem endosomalen pH in endosomale Vesikel und wird dabei selbst wieder verwendet. |
Kultur von Dendritischen Zellen (DCs)
PBL wurden in serumfreien RPMI-1640 in einer Konzentration von 2,5x106 pro ml in 6-Well-Platten ausgesät, mit einer Gesamtzellzahl von 5x106 Zellen pro Plattenvertiefung. Die Platten wurden dann für zwei Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. In der Zwischenzeit hat sich eine adhärente Zellfraktion, von einer nicht-adhärenten Zellfraktion abgesetzt, die vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette von der adhärenten Zellschicht heruntergewaschen und für späteren Gebrauch aufgehoben wurde. Dabei mußte beachtet werden, daß das gesamte Kulturmedium mit den nicht-adhärenten Zellen entfernt wurde. Die adhärenten Zellen wurden weiter kultiviert unter Zugabe von 2 ml serumfreien Medium (X-VIVO-15), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin (100 U/ml und 100 μg/ml), sowie 800 IU/ml rekombinantem humanes GM-CSF und 500 IU/ml rekombinantem humanes IL-4. Nach sieben Tagen in Kultur wurde frisches rhGM-CSF (800 IU/ml) dem Kulturmedium zugegeben und nach 10-12 Tagen Zellkultur konnten die unreifen DCs geerntet und für weiterführende Experimente verwendet werden. [...] Phänotypische Analyse von DCs Zur Charakterisierung von DCs mittels direkter Immunfluoreszenz wurden die folgenden monoklonalen Antikörper verwendet, die entweder mit Fluorescein-isothiocyanate (FITC) oder Phycoerythrin (PE) direktmarkiert waren: CD1a (FITC,-oder PE-konjugiert), CD11c-PE, CD11a –FITC, CD123-PE, CD25-FITC, CD40 (FITC,-oder PE-konjugiert), CD80, CD86, (FITC,-oder PE-konjugiert), CD51-PE, HLA-ABC und HLA-DR (FITC,-oder PE-konjugiert), CD19-FITC, CD83-PE und CD14-PE [Seite 66] Bestimmung der endozytotischen Kapazität von DCs mittels FITC-Dextran Die Mannoserezeptor vermittelte Endozytose stellt experimentell ein Maß für die Funktionalität von DCs dar. Aufgrund multipler Kohlenhydratbindungsdomänen des Mannoserezeptors, sind DCs befähigt große Mengen an Glykoproteinen zu binden und zu internalisieren. Im Gegensatz zu Fc- [Seite 67] Rezeptoren, die zusammen mit ihren Liganden degradiert werden, entläßt der Mannoserezeptor seine Liganden bei einem endosomalen pH in endosomale Vesikel und wird dabei selbst wiederverwendet. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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