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| Untersuchte Arbeit: Seite: 33, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 63, Zeilen: 4 ff. |
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| Die Kryogefäße wurden direkt aus dem Behälter mit flüssigem Stickstoff entnommen und sofort für kurze Zeit in einem Wasserbad von 37 °C aufgetaut. Es wurde darauf geachtet, daß nicht der gesamte Inhalt des Gefäßes auftaut, sondern noch ein kleiner gefrorener Anteil im Innern des Gefäßes verblieb.
Ein Milliliter des Auftaumediums wurde vorsichtig mit einer Pasteurpipette in das Kryogefäß pipettiert und dabei auch das letzte Klümpchen geschmolzen. Die Zellsuspension wurde dann, mit Hilfe der Pasteurpipette tropfenweise in das 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, das kontinuierlich leicht geschüttelt wurde. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt und in einem geeigneten Volumen von komplettem Medium aufgenommen und für weitere Experimente verwendet. KULTUR VON ADHÄRENTEN ZELLLINIEN (GHD, HUMANE FIBROBLASTEN) Die murine Fibroblasten Zelllinie L-CD40L wurde nach bereits beschriebener Methodik aufgetaut und in 6ml kompletten RPMI-1640 Medium aufgenommen und danach in 25 cm2 Zellkulturflaschen ausgelegt. Nach 24 h hatten sich ca. 60 % aller Zellen auf dem Flaschenboden angeheftet. Nach weiteren 18- 24 h war der gesamte Flaschenboden mit einem konfluenten Zellrasen bedeckt, man nennt dies Konfluenz. Das Passagieren dieser Zellen wurde wie folgt durchgeführt. Zunächst wurde das Medium abgesaugt und 5 ml PBS in die Kulturflasche gegeben. Unter kreisenden Bewegungen wurde das PBS auf den Zellen verteilt um einen Wascheffekt zu erzielen. Danach wurde das PBS abgesaugt und ca. 500 μl Versene zugegeben, ein Trypsinderivat, das die Zell-Zellkontakte lösen soll. Das Versene wurde durch Klopfen und Kreisen der Kulturflaschen gut verteilt und anschließend für 5 Min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die Ablösung der Zellen im Mikroskop kontrolliert. Zum vollständigen Ablösen der Zellen mußten diese vom Flaschenboden abgeklopft werden und in ca. 5- 10 ml CM aufgenommen werden. Nach einem Waschschritt um das Versene gründlich zu entfernen, wurde diese Zellsuspension dann in 75 cm2 Zellkulturflaschen transferiert und mit komplettem RPMI-1640 Medium auf ein Gesamtvolumen von 15 ml aufgefüllt. |
Die Kryogefäße wurden direkt aus dem Behälter mit flüssigem Stickstoff geholt und sofort für kurze Zeit in einem Wasserbad von 37 °C zum Auftauen gebracht. Dabei ist zu beachten, daß nicht der gesamte Inhalt des Gefäßes auftaut, sondern sich noch ein kleines gefrorenes Klümpchen im Innern des Gefäßes befindet.
Ein ml des Auftaumediums wurde nun vorsichtig mit einer Pasteurpipette in das Kryogefäß pipettiert und dabei auch das letzte Klümpchen zum Auftauen gebracht. Die Zellsuspension wurde dann, mit Hilfe der Pasteurpipette tropfenweise in das 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, das währenddessen kontinuierlich leicht geschüttelt wurde. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgesaugt und dann in einem geeigneten Volumen von komplettem Medium aufgenommen und für weitere Experimente verwendet. Kultur von adhärenten Zellinien (L-Zellen-CD40L, Hela –Zellen, humane Fibroblasten) Die murine Fibroblasten Zellinie L-CD40L wurde nach bereits beschriebener Methodik aufgetaut und in 6ml kompletten RPMI-1640 Medium aufgenommen und danach in 25 cm2 Zellkulturflaschen ausgelegt. Nach 24 h haben sich ca. 60 % aller Zellen auf dem Flaschenboden angeheftet. Nach weiteren 18- 24 h war der gesamte Flaschenboden mit einem zusammenhängenden Zellrasen bedeckt, man nennt dies Konfluenz. Das Passagieren dieser Zellen wurde folgendermaßen durchgeführt. Zunächst wurde das Medium abgesaugt und 5 ml PBS in die Kulturflasche gegeben. Unter kreisenden Bewegungen wurde das PBS auf den Zellen verteilt um einen Wascheffekt zu erzielen. Danach wurde das PBS abgesaugt und ca. 500 μl Versene zugegeben, ein Trypsinderivat, das die Zell-Zellkontakte lösen soll. Das Versene wurde durch Klopfen und Kreisen der Kulturflaschen gut verteilt und anschließend für 5 Min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden sich ablösende Zellen im Mikroskop kontrolliert. Zum vollständigen Ablösen der Zellen mußten diese vom Flaschenboden abgeklopft werden und in ca. 5- 10 ml CM aufgenommen werden. Diese Zellsuspension wurde dann in 75 cm2 Zellkulturflaschen transferriert [sic] und mit komplettem RPMI-1640 Medium auf ein Gesamtvolumen von 15 ml aufgefüllt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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