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| Untersuchte Arbeit: Seite: 31, Zeilen: 3-33 |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 61, Zeilen: 1 ff. |
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| EXTRAKTION VON MONONUKLEÄREN ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTES (PBL)
Das für diese Arbeit verwendete Blut wurde entweder als Vollblut (50-100 ml), aus der Armvene von gesunden freiwilligen Spendern entnommen oder stammte von leukozytenhaltigen Präparaten („buffy coats“) des Bayerischen Roten Kreuzes. Das Blut wurde mit sterilen Einmalspritzen entnommen, denen 0.1 ml (500 IU) Heparin Novo pro 10 ml Blut beigesetzt war, um die Gerinnung des Blutes zu verhindern. Das so behandelte Blut wurde unmittelbar für die entsprechenden Experimente weiterverarbeitet. Die serologische Überprüfung aller Blutspendeproben zeigten Immunglobuline sowohl gegen AdV als auch gegen EBV. Dies wurde vom Instiut [sic] für medizinische Mikrobiologie des Max von Pettenkofer Institutes, München bestätigt. Alle folgenden im Zusammenhang mit Zellseparation und Zellkultivierung beschriebenen Vorgänge wurden unter strikt sterilen Bedingungen vorgenommen. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden mittels Ficoll- Hypaque (spezifische Dichte = 1,078) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Dabei wurde das Blut zunächst im Verhältnis 1:1 mit Dulbeccos-PBS verdünnt. In 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden 20 ml Ficollösung vorgelegt, auf die das verdünnte Blut vorsichtig mit einer 10ml Pipette überschichtet wurde. Nach 20minütiger Zentrifugation bei 800 g hat sich die mononukleäre Fraktion der Lymphozyten und Monozyten aufgrund ihrer geringeren Dichte deutlich von den Erythrozyten, den Granulozyten abgegrenzt. Während letztere durch das Ficoll- Hypaque hindurch zentrifugiert wurden, bildeten die mononukleären Zellen eine milchige Scheibe, die leicht aus dem Ficoll mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette aufgenommen werden konnte. Diese Zellen wurden dann in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und im Verhältnis 1:1 mit Dulbeccos-PBS gewaschen und 10 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Der Überstand abgesaugt und das Pellet nach leichtem Aufschütteln in 50ml Dulbeccos-PBS aufgenommen und 10 Minuten bei 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand wieder abgesaugt, das Pellet kurz aufgeschüttelt und in 10 - 20 ml RPMI-1640 Medium aufgenommen und sorgfältig durchmischt. Die Zellen wurden anschließend mit einem Hämatozytometer gezählt. |
Extraktion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBL)
Das für diese Arbeit verwendete Blut wurde entweder als Vollblut (50-100 ml), aus der Armvene von gesunden freiwilligen Spendern entnommen oder stammte von käuflich erworbenen leukozytenhaltigen Präparaten („buffy coats“) des Bayerischen Roten Kreuzes. Das Blut wurde mit sterilen Einmalspritzen entnommen, denen 0.1 ml (500 IU) heparin Novo pro 10 ml Blut beigesetzt war, um ein Gerinnen des Blutes zu verhindern. Das so behandelte Blut wurde unmittelbar für die entsprechenden Experimente weiterverarbeitet. Die serologische Überprüfung aller Blutspendeproben zeigten Immunglobuline sowohl gegen AdV als auch gegen EBV. Dies wurde vom Instiut [sic] für medizinische Mirobiologie [sic] des Max von Pettenkofer Institutes, München bestätigt. Alle folgenden im Zusammenhang mit Zellseparation und Zellkultivierung beschriebenen Vorgänge wurden unter strikt sterilen Bedingungen vorgenommen. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden mittels Ficoll-Hypaque (spezifische Dichte = 1,078) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Dabei wurde das Blut zunächst im Verhältnis 1:1 mit Dulbeccos-PBS verdünnt. In 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden 20 ml Ficollösung vorgelegt, auf die das verdünnte Blut vorsichtig mit einer 10ml Pipette überschichtet wurde. Nach 20minütigem Zentrifugieren bei 800 g hat sich die mononukleäre Fraktion der Lymphozyten und Monozyten aufgrund ihrer geringeren Dichte deutlich von den Erythrozyten, den Granulozyten abgegrenzt. Während letztere durch das Ficoll-Hypaque hindurch zentrifugiert wurden, bilden die Mononukleären Zellen einen deutlichen Ring, der leicht aus dem Ficoll mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette aufgenommen werden konnte. Diese Zellen wurden dann in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und im Verhältnis 1:1 mit Dulbeccos-PBS gewaschen und 10 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgesaugt und das Pellet nach leichtem Aufschütteln in 50ml Dulbeccos-PBS aufgenommen und ein weiteres Mal 10 Minuten bei 1800 rpm zentrifugiert. Danach wurde der Überstand wieder abgesaugt, das Pellet kurz aufgeschüttelt und in 10 - 20 ml RPMI-1640 Medium aufgenommen und durch mehrmaliges auf und ab pipettieren sorgfältig durchmischt. Die Zellen wurden anschließend mit einem Hämatozytometer gezählt. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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