von Dr. Daniel Müller
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| [1.] Dml/Fragment 042 04 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2018-03-16 16:38:25 Schumann | Dml, Fragment, Gesichtet, Regn 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 42, Zeilen: 4-32 |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 77, Zeilen: 1 ff. |
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| STANDARD CHROMFREISETZUNGS TEST (CHROMIUM-51 RELEASE ASSAYS)
Allgmeine [sic] Vorbereitungen zum Chromfreisetzungs Test: Autologe dendritische Zellen wurden aus frischem Blut oder von eingefrorenen PBL von „buffycoats“ 14 Tage vor der Durchführung des Assays wie beschrieben generiert. Dabei mußten die Menge [sic] so kalkuliert werden, daß folgende Zielzellen hergestellt werden konnten:
In der gleichen Weise wurden allogene dendritische Zellen von HLA-nicht identischen Spendern oder von „buffycoats“ mit der Annahme nicht übereinstimmender HLA-Typen generiert. Darüber hinaus dienten autologe LCLs, allogene LCLs und die NK-sensitive Zell-Linie HSB2 als weitere Zielzellen. Der Chromfreisetzungs Test dient zur Überprüfung der spezifischen Zellvermittelnden Zytotoxizität. Die CTLs wurden geerntet und in einer Konzentration von 2x106 Zellen /ml in komplettem RPMI aufgenommen. 96 Well Spitzbodenplatten wurden von Reihe B bis D mit jeweils 100μl komplettem RPMI pro Well gefüllt. In die oberste Reihe A, wurden 200 μl der CTL-Suspension gefüllt. Mit Hilfe einer 12-Kanal Multipette wurden dann jeweils 100 μl, angefangen bei Reihe A in die jeweils tiefer liegende Reihe pipettiert. Bei jedem Transferschritt wurden dann Zellsuspension und Medium sorgfältig durch zahlreiches Auf- und Abpipettieren durchmischt um eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Bei Reihe D schließlich wurden 100 μl verworfen, da hier die Verdünnungskaskade beendet wurde. Die Reihen E und F waren für die HLA-Inhibitionsexperimente vorgesehen. In Reihe G wurden 100μl Medium und später die Chrom markierten Zielzellen für die Ermittlung der spontanen Chromfreisetzung gegeben und in Reihe H wurde schließlich das Detergenz Triton-X zugegeben, um die maximalen Freisetzung des gespeicherten Chroms zu bestimmen. |
Vorbereitung der Zielzellen für den Zytotoxizitäts-Assay
Autologe Dendritische Zellen wurden aus frischem Blut oder von eingefrorenen PBL von „buffycoats“ 14 Tage vor der Durchführung des Assays wie beschrieben generiert. Dabei mußten die Mengen so kalkuliert werden, daß folgende Zielzellen hergestellt werden konnten:
Standard Chromfreisetzungs Test („chromium-51 release assays“) oder Test zur Überprüfung der spezifischen Zell-vermittelnden Zytotoxizität Die ZTL wurden geerntet und in einer Konzentration von 2x106 Zellen /ml in komplettem RPMI aufgenommen. 96 Well Spitzbodenplatten wurden von Reihe B bis D mit jeweils 100μl komplettem RPMI pro Well gefüllt. In die oberste Reihe A, wurden 200 μl der ZTL-Suspension gefüllt. Mit Hilfe einer 12-Kanal Multipette wurden dann jeweils 100 μl, angefangen bei Reihe A in die jeweils tiefer liegende Reihe pipettiert. Bei jedem Transferschritt wurden dann Zellsuspension und Medium sorgfältig durch zahlreiches Auf- und Abpipettieren durchmischt um eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Bei Reihe D schließlich wurden 100 μl verworfen, da hier die Verdünnungskaskade beendet wurde. Die Reihen E und F waren für die HLA-Inhibitionsexperimente vorgesehen. In Reihe G wurden 100μl Medium und später die Chrom markierten Zielzellen für die Ermittlung der spontanen Chromfreisetzung gegeben und in Reihe H wurde schließlich das Detergenz Triton-X zugegeben, um die maximalen Freisetzung des gespeicherten Chroms zu bestimmen. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
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