von Dr. Daniel Müller
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| [1.] Dml/Fragment 041 01 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2018-03-14 17:19:11 Schumann | Dml, Fragment, Gesichtet, KomplettPlagiat, Regn 2002, SMWFragment, Schutzlevel sysop |
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| Untersuchte Arbeit: Seite: 41, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Regn 2002 Seite(n): 74, 75, Zeilen: 74: 12 ff., 75: 1 ff. |
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| [Die] antigenpräsentierenden Stimulatorzellen (DCs oder LCLs) wurden zunächst bestrahlt (30 gy für DCs und 45 gy für LCLs) und in verschiedenen Ratios in dreier Gruppen (Triplikate) zu den T-Zellen gegeben. Aufgrund der individuellen Unterschiede in der Reinheit der verschiedenen DC-Kulturen wurden die DCs immer sehr genau und sorgfältig auf die entsprechende Zellkonzentrationen eingestellt. Dabei wurde zunächst die Quantität der DCs im FACS evaluiert und anschließen [sic] die deutlich größeren Zellen gezählt [sic] während die kleineren Lymphozyten ignoriert wurden. Da LCLs relativ homogene Zellsuspensionskulturen darstellen, war hier das Einstellen auf die jeweilige Zellzahl einfacher. Die Endkonzentration in jedem Well betrug 200μl. Jeweils drei Wells wurden mit T-Zellen alleine als negative Kontrolle versehen. Nach 6 Tagen in Kultur wurde 1 μCi von Methyl-[3H]Thymidin der Kultur zugegeben und für weitere 18 Stunden inkubiert. Nur sich replizierende T-Zellen können das Methyl- [3H]Thymidin in ihre DNA einbauen. Nach Ende der Inkubationszeit wurden die [3H]Thymidin –markierten Zellen in den 96-Well-Rundbodenplatten mit Hilfe eines FilterMate TM Cell Harvester auf speziell entwickelte UniFilter-Platten transferiert und die Aufnahme des Thymidins wurde als emittierende Gamma-Strahlung im Liquid-Scintillations-Verfahren mit Hilfe eines Packard Topcounters quantifiziert. Als Maß für die Proliferation wurden counts per minute (CPM) angegeben, welche die Menge des eingebauten Thymidins repräsentieren. Die proliferierenden T-Zellen in der MLR wurden in der FACS –Analyse phänotypisiert, dabei wurden die oben beschriebenen Antikörper eingesetzt.
Unreife dendritische Zellen sind in der Lage exogene Antigene aufzunehmen und sie den T-Zellen zu präsentieren. Um diese Fähigkeit der DCs zu testen wurden RNA-infizierte DCs oder nicht infizierte DCs in komplettem Medium resuspendiert, das 20mg/ml rekombinantes Tetanus Toxoid (TT) Fragment C (Chiron Behring, Marburg) enthielt oder ohne Zusatz war. Nach 24 Stunden wurden die Zellen bestrahlt (30 Gy) und in Triplikaten zu den aufgereinigten T-Zellen (1x105/ Well) in verschiedenen Stimulator:T-Zell Ratios in 96-Well Rundbodenplatten gegeben. Nach 5 Tagen in Kultur wurde 1 μCi Methyl- [3H]Thymidin der Kultur zugegeben und für weitere 18 Stunden inkubiert. Danach wurde dann wie bereits beschrieben der Einbau des Thymidins in die proliferierenden Zellen quantifiziert. |
Die antigenpräsentierenden Stimulatorzellen (DCs oder LCLs) wurden zunächst bestrahlt (30 gy für DCs und 45 gy für LCLs) und in verschiedenen Ratios in dreier Gruppen (Triplicates) zu den T-Zellen gegeben. Aufgrund der individuellen Unterschiede in der Reinheit der verschiedenen DC-Kulturen wurden die DCs immer sehr genau und sorgfältig auf die entsprechende Zellkonzentrationen eingestellt. Dabei wurde zunächst die Quantität der DCs im FACS evaluiert und anschließend nur die großen runden Zellen gezählt, kleine Lymphozyten wurden dabei ignoriert. Da LCLs relativ homogene Zellsuspensionskulturen darstellen war hier das Einstellen auf die jeweilige Zellzahl einfacher. Die Endkonzentration in jedem Well betrug 200μl. Jeweils drei Wells wurden mit T-Zellen alleine als negative Kontrolle versehen. Nach 6 Tagen in Kultur wurde 1 μCi von Methyl-[3H]Thymidin der Kultur zugegeben und für weitere 18 Stunden inkubiert. Nur sich replizierende T-Zellen können das Methyl-[3H]Thymidin in ihre DNA einbauen. Nach Ende der Inkubationszeit wurden die [3H]Thymidin –markierten Zellen in den 96-Well-Rundbodenplatten mit Hilfe eines FilterMate TM Cell Harvester auf speziell entwickelte UniFilter-Platten transferiert und die Aufnahme des Thymidins wurde als emittierende β-Strahlung im Liquid-Scintillations-Verfahren mit Hilfe eines Packard Topcounters quantifiziert. Als Maß für die Proliferation wurden counts per minute (CPM) angegeben, welche die Menge des eingebauten Thymidins repräsentieren. Die proliferierenden T-Zellen in der MLR wurden in der FACS –Analyse phänotypisiert, dabei wurden monoklonale Antikörper, die gegen CD3, CD4, CD8 und CD56 gerichtet waren verwendet.
[Seite 75] Autologe MLR Unreife Dendritische Zellen sind in der Lage exogene Antigene aufzunehmen und sie den T-Zellen zu präsentieren. Um diese Fähigkeit der DCs zu testen wurden AdV-infizierte DCs oder nicht infizierte DCs in komplettem Medium resuspendiert, das 20mg/ml rekombinantes tetanus toxoid (TT) Fragment C (Chiron Behring, Marburg) enthielt oder ohne Zusatz war. Nach 24 Stunden wurden die Zellen bestrahlt (30 Gy) und in Triplikaten zu den aufgereinigten T-Zellen (1x105/ Well) in verschiedenen Stimulator:T-Zell Ratios in 96-Well Rundbodenplatten gegeben. Nach 5 Tagen in Kultur wurde 1 μCi Methyl-[3H]Thymidin der Kultur zugegeben und für weitere 18 Stunden inkubiert. Danach wurde dann wie bereits beschrieben der Einbau des Thymidins in die proliferierenden Zellen quantifiziert. |
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