von Anahit Hovsepian
Statistik und Sichtungsnachweis dieser Seite findet sich am Artikelende
| [1.] Anh/Fragment 028 03 - Diskussion Zuletzt bearbeitet: 2014-09-27 21:33:57 Schumann | Anh, Burkert 2006, Fragment, Gesichtet, SMWFragment, Schutzlevel sysop, Verschleierung |
|
|
|
| Untersuchte Arbeit: Seite: 28, Zeilen: 3-22 |
Quelle: Burkert 2006 Seite(n): 33, Zeilen: 4ff |
|---|---|
| Die fluoreszierende Eigenschaft des Calcium-sensitiven Farbstoffes Fura-2 Pentaacetoxymethylester (Calbiochem, San Diego, CA, USA) wurde sich zunutze gemacht. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wurde in Form von lipophilem Acetoxymethylester (AM), der zellmembranpermeabel und insensitiv für Ionen ist, appliziert. Im Zytosol der Monozyten wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen gespalten, wodurch die freie Säure des Fluoreszenzfarbstoffes gebildet wird, die ionensensitiv und nicht mehr zellmembranpermeabel ist (Moore et al., 1990).
1 ml der isolierten Monozyten wurde nach Resuspension in physiologischer Elektrolytlösung mit vier verschiedenen Caciumkonzentrationen: 0.5, 1.0, 1.5 und 2.0 mmol/L 3 Stunden, im Anschluss eine weitere Stunde mit 2 μl Farbstoff Fura-2-AM im Wasserbad bei 37°C inkubiert und anschließend bei einer Exzitationsstrahlung von 340 bzw. 485 nm mit einer Emission von 510 nm fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Zur Quantifizierung der intrazellulären Calciumionenkonzentration Fura-2-AM beladener Monozyten wurde die Fluoreszenz-Ratio-Methode angewandt (Rodland et al., 1997; Scholze et al., 2005). Hierbei wird der Quotient aus der gemessenen Fluoreszenz bei 340 nm und 485 nm gebildet. Bei einer Exzitationswellenlänge von 340 nm wird die calciumgebundene Form des Farbstoffes angeregt. Mit steigender Calciumionenkonzentration kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz bei 340 nm. Bei 485 nm dagegen ist die Fluoreszenz, die vom Farbstoff ausgeht, Calcium-unabhängig. Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche [Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio Messung eliminiert.] |
Die fluoreszierende Eigenschaft des Calcium-sensitiven Farbstoffes Fura-2 Pentaacetoxymethylester (Calbiochem, San Diego, CA, USA) wurde sich zunutze gemacht. Dieser Fluoreszenzfarbstoff wurde in Form von lipophilem Acetoxymethylester (AM), der zellmembranpermeabel und insensitiv für Ionen ist, appliziert. Im Zytosol der Monozyten wird der Ester durch intrazelluläre Esterasen gespalten, wodurch die freie Säure des Fluoreszenzfarbstoffes gebildet wird, die ionensensitiv und nicht mehr zellmembranpermeabel ist (Moore et al., 1990).
1 ml der isolierten Monozyten wurde nach Resuspension in physiologischer Elektrolytlösung mit 2 μl Farbstoff Fura-2-AM für 1 Stunde bei 4°C inkubiert und anschließend bei einer Exzitationsstrahlung von 340 bzw. 485 nm mit einer Emission von 510 nm fluoreszenzspektrophotometrisch gemessen. Zur Quantifizierung der intrazellulären Calciumionenkonzentration Fura-2-AM beladener Monozyten wurde die Fluoreszenz-Ratio-Methode angewandt (Rodland et al., 1997; Scholze et al., 2005). Hierbei wird der Quotient aus der gemessenen Fluoreszenz bei 340 nm und 485 nm gebildet. Bei einer Exzitationswellenlänge von 340 nm wird die calciumgebundene Form des Farbstoffes angeregt. Mit steigender Calciumionenkonzentration kommt es zu einem Anstieg der Fluoreszenz bei 340 nm. Bei 485 nm dagegen ist die Fluoreszenz, die vom Farbstoff ausgeht, Calcium-unabhängig. Eventuelle Fehlerquellen, wie z.B. Unterschiede in der Farbstoffkonzentration oder Farbstoffverteilung innerhalb der Zellen, unterschiedliche Zelldurchmesser, Ausbleichen oder Ausströmen des Farbstoffs werden mit Hilfe dieser Ratio-Messung eliminiert. |
Ein Verweis auf die Quelle fehlt. |
|
Letzte Bearbeitung dieser Seite: durch Benutzer:Schumann, Zeitstempel: 20140927213440