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| Untersuchte Arbeit: Seite: 86, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Frank 2000 Seite(n): 57-58, Zeilen: 57: 12 ff. - 58: 5-10 |
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| Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s.3.2.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s.3.2.1) muß beachtet werden, dass diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigte die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s.3.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Zuletzt wurde die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml SFM10 (s.3.2.3)) in die obere Vertiefung gegeben.
Inkubation Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s.3.1) und diese für den gewünschten Zeitraum, meist für 3 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert. Gewinnung der PMN Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen und dann vollständig entnommen, ohne dabei die Membran zu beschädigen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde verworfen und die Membran mit einem sterilen Wattetupfer vorsichtig getrocknet. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Kammerteil möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (=gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde jede der Vertiefungen der unteren Platte geleert. Die Zellsuspension (435 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS (s.3.2.4) in ein 14 ml Röhrchen übertragen, gut durchpipettiert und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 Min [zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen.] |
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Diese Flüssigkeit wurde mit 115 μl unverdünntem Percoll® (s. 3.1.4) unterschichtet, das als eine Art „Auffangkissen“ und somit zur Verminderung der Adhärenz der gewanderten Zellen diente. Das Gesamtvolumen von 415 μl führte zur Bildung eines geringgradig positiven Flüssigkeitsmeniskus, um Luftblasen beim Auflegen der Membran zu vermeiden. Bei der Polycarbonatmembran (s. 3.1.1 u. 3.1.8.3) muß beachtet werden, daß diese eine glänzende (PVP-beschichtete) und eine matte, unbeschichtete Seite besitzt. Nach Angaben des Vertreibers der Membranen (Cytogen, Ober-Mörlen) adhärieren Zellen stärker an PVP als an das unbeschichtete Polycarbonat. Damit die Zellen nicht nach der Migration an der Unterseite der Membran verstärkt adhärieren, zeigt die PVP-Seite in allen Versuchsansätzen nach oben. Die trockene Polycarbonatmembran wurde vorsichtig auf die Vertiefungen gelegt, wobei man die zwei Enden der Membran mit zwei anatomischen Pinzetten (s. 3.1.1) faßte. Die Membran muß dabei U-förmig durchhängen, um sie mittig beginnend nach außen luftblasenfrei auslegen zu können. Anschließend wurde die Silikondichtung aufgelegt, der zweite Acrylanteil der Kammer aufgedrückt und unter leichtem Druck festgeschraubt. Falls nicht andere Versuchsvorgaben zu berücksichtigen waren, wurde zuletzt die Zellsuspension (200 μl, meist 2 x 107 Zellen/ml R0+ ) in die obere Vertiefung gegeben. Inkubation: Zur Inkubation wurde die Transmigrationskammer in eine feuchte Kammer gestellt (s. 3.1.8.4) und diese für den gewünschten Zeitraum, normalerweise für 2 Stunden, bei 37°C und 5% CO2, in einem Brutschrank inkubiert. Gewinnung der Zellfraktionen: Die Zellsuspension in den oberen Wells (= nicht gewanderte Zellen) wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert, um adhärente Zellen von der Oberseite der Membran zu lösen, und dann entnommen. Dabei setzt man die Pipettenspitze möglichst am Rand der Membran vorsichtig auf, damit ein Durchstoßen der Membran vermieden wird. Die entnommene Zellsuspension wurde in ein Probenröhrchen für die Auswertung im Durchflußzytometer gegeben. Da sich an der Unterseite der Polycarbonatmembran noch Zellen befinden und diese in benachbarte Wells gelangen könnten, wurde nach Entfernung der Schraubenmuttern der obere Teil der Kammer möglichst waagerecht und zügig abgehoben. Hierbei löst sich die Silikonmatte und die Membran mit ab. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension (= gewanderte Zellen) und des Percolls® wurde die Vertiefung der unteren Platte geleert. [Seite 58] [...] Der nicht für die Zellzahlbestimmung benötigte Teil der Zellsuspension (350 μl, etwa 15 μl Flüssigkeitsverlust pro Well durch das Abheben der Membran) wurde dann in etwa 12 ml PBS in ein 14 ml Röhrchen gegeben und einmal bei 100 x g und 4°C für 8 min zentrifugiert, um Percoll® und andere lösliche Komponenten zu entfernen. |
Ohne Hinweis auf eine Übernahme. Fortsetzung von Ad/Fragment_085_12. Der ursprüngliche Autor wird einmal auf der vorangegangenen Seite en passant erwähnt. |
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