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| Untersuchte Arbeit: Seite: 80, Zeilen: 1-21 |
Quelle: Frank 2000 Seite(n): 41, Zeilen: 15-35 |
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| Die Erfassung der Fähigkeit von Leukozyten zu phagozytieren, erfordert für die durchflusszytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 1,5 ml mikrobieller Partikel Suspension (MIM) mit 3,5 ml FITC-Puffer (FITC-Endkonzentration 0,00066%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%,) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s.3.2.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS (3.2.4) bei 14.000 x g für 1 Minute gewaschen und dann auf ca 2 x 108 Mikroben/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürker (3.1), Fluoreszenzmikroskop (3.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.
Serum zur Opsonisierung der Mikroben Zur Opsonisierung der mikrobiellen Partikel wurde natives gepooltes Pferdeserum verwendet, das von 3 gesunden Pferden unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, 3.2.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen für 15 Min mit 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 Min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100 μl, 200 μl und 1 ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS (3.2.4) verdünnte Gebrauchslösung. |
Die Erfassung der Phagozytosefähigkeit von PMN erfordert für die durchflußzytometrische Messung eine Fluoreszenzmarkierung der Ingestionspartikel. Hierzu wurden 3 ml einer standardisierten Streptokokken-Lösung (Omnisorb®, s. 3.1.2) mit 7 ml FITC-Puffer (s. 3.1.3.1, FITC-Endkonzentration 0,015%) und 50 μl 10%igem Natriumazid (Endkonzentration 0,05%, s. 3.1.2) in lichtgeschützten Eppendorf-Reaktionsgefäßen (s. 3.1.1) für 20 Stunden bei Raumtemperatur im Überkopfrüttler durchmischt. Danach wurde diese Suspension dreimal mit PBS bei 14.000 x g für 1 min gewaschen und dann auf 2 x 108 Bakterien/ml PBS (Zellzählkammer nach Bürkner, Fluoreszenzmikroskop s.3.1.1) eingestellt. In aliquoten Teilen zu 1 ml wurde diese Suspension bei –20°C gelagert.
Serum zur Opsonisierung der Streptokokken Zur Opsonisierung der Bakterien wurde natives Serum verwendet, das aus dem Blut von drei Kühen der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover unter keimarmen Bedingungen (Vacutainer ohne Gerinnungshemmer, s. 3.1.1) gewonnen wurde. Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen, bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen 15 min mit 2.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand gewonnen und bei 3.500 x g für 10 min zentrifugiert. Danach wurde das Serum der drei Tiere zu gleichen Anteilen zusammengegeben (gepoolt). Die Lagerung erfolgte in aliquoten Teilen zu 100μl, 200μl und 1ml bei –80°C. Zum Einsatz kam eine 1:10 mit PBS verdünnte Gebrauchslösung. |
Im wesentlichen werden hier nur aus "Kühen" "Pferde" und aus "Bakterien" "mikrobielle Partikel". Kein Hinweis auf eine Übernahme. |
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