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| Untersuchte Arbeit: Seite: 64, Zeilen: 1 ff. (komplett) |
Quelle: Bente 2003 Seite(n): 35, 36, 38, Zeilen: 35: 30 ff.; 36: 1 ff.; 38: 11 ff. |
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| [Eine Auswertung in] Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al.1997). Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: Einem nicht spezifischen Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifischen Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001).
Detektionssystem mit interkalierenden Farbstoffen Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb.5). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). |
Eine Auswertung in Echtzeit (engl.: real-time) war nun möglich (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997).
Die Visualisierung des Amplikons ist grundsätzlich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen möglich: einem nichtspezifisches Detektionssystem, welches auf der Markierung des Amplikons durch interkalierende Farbstoffe basiert, und einem spezifisches Detektionssystem, das fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Beide Detektionsmethoden beruhen auf der Tatsache, dass der Anstieg der Fluoreszenz proportional zum Anstieg der Konzentration des Amplifikationsproduktes ist. Aufgrund einer [Seite 36:] Proportionalität der Fluoreszenz und der entstehenden Amplifikate ist zudem eine Quantifizierung der Ausgangs-DNA möglich. Die während des Amplifikationsprozesses emittierte Fluoreszenz wird während jedes PCR-Zyklus gemessen und ermöglicht so eine graphische Darstellung der Amplifikation, die es dem Anwender erlaubt, die Reaktion in Echtzeit zu beobachten. Da sich die Kinetik der PCR-Reaktion beobachten lässt, wird manchmal auch der Begriff kinetische PCR verwendet (WALKER 2002; LEUTENEGGER 2001). [Seite 38:] 2.3.3.1 Interkalierende Farbstoffe Interkalierende Farbstoffe waren der erste Entwicklungsschritt zur Visualisierung des entstehenden Amplikons (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Sie emittieren, nach Anregung durch energiereiches UV-Licht, Licht im sichtbaren energieärmeren Wellenlängenbereich (Fluoreszenz). Liegt der Farbstoff frei vor, ist die Emission sehr gering. Erst durch die Interkalierung des Farbstoffs in die kleine Windung der doppelsträngigen DNA wird die Lichtemission stark verstärkt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Die Fähigkeit des Farbstoffs zur Einlagerung in die kleinen Windungen der DNA ist auf seinen planaren Molekülaufbau zurückzuführen (Abb. 2.6). Der für diese Zwecke als erstes genutzte Farbstoff war Ethidiumbromid. Inzwischen ist dieser Farbstoff von anderen Farbstoffen wie z.B. Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR Green™ (MOLECULAR PROBES INC.) aufgrund eines besseren Signal-Hintergrund-Verhältnisses ersetzt worden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist SYBR Green™, der eine Anregungswellenlänge von 497 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm besitzt (HIGUCHI et al. 1992, 1993). |
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